На главную              К списку выставок

Биокатализ. Фундаментальные основы и применение.

Журнальные статьи

Abin-Fuentes A. et al. Exploring the Mechanism of Biocatalyst Inhibition in Microbial Desulfurization // Applied and Environmental Microbiology. 2013. Vol. 79, № 24. P. 7807–7817.

Microbial desulfurization, or biodesulfurization (BDS), of fuels is a promising technology because it can desulfurize compounds that are recalcitrant to the current standard technology in the oil industry. One of the obstacles to the commercialization of BDS is the reduction in biocatalyst activity concomitant with the accumulation of the end product, 2-hydroxybiphenyl (HBP), during the process. BDS experiments were performed by incubating Rhodococcus erythropolis IGTS8 resting-cell suspensions with hexadecane at 0.50 (vol/vol) containing 10 mM dibenzothiophene. The resin Dowex Optipore SD-2 was added to the BDS experiments at resin concentrations of 0, 10, or 50 g resin/liter total volume. The HBP concentration within the cytoplasm was estimated to decrease from 1,100 to 260 mu M with increasing resin concentration. Despite this finding, productivity did not increase with the resin concentration. This led us to focus on the susceptibility of the desulfurization enzymes toward HBP. Dose-response experiments were performed to identify major inhibitory interactions in the most common BDS pathway, the 4S pathway. HBP was responsible for three of the four major inhibitory interactions identified.

Agudo R. et al. Biocatalytic Route to Chiral Acyloins: P450-Catalyzed Regio- and Enantioselective alpha-Hydroxylation of Ketones // J. Org. Chem. 2015. Vol. 80, № 2. P. 950–956.

P450-BM3 and mutants of this monooxygenase generated by directed evolution are excellent catalysts for the oxidative a-hydroxylation of ketones with formation of chiral acyloins with high regioselectivity (up to 99%) and enantioselectivity (up to 99% ee). This constitutes a new route to a class of chiral compounds that are useful intermediates in the synthesis of many kinds of biologically active compounds.

Basak S. et al. Recent trends of polymer-protein conjugate application in biocatalysis: A review // Polymer Reviews. 2015. Vol. 55, № 1. P. 163–198.

Proteins, particularly enzymes, are often used in bioreactors to catalyze biosynthetic reactions. However, one of the major challenges in applying proteins in bioreactors is enzyme stability and recovery. This review is an enlightening discussion on recent trends and advancements used to alleviate these limitations completely or to minimize them. Two major strategies, polymer-based enzyme immobilization and polymeric enzyme nanoreactors have been discussed systematically. Further, this review puts light on various methods such as smart polymer-based supports which have been exploited for their ability to regulate ligand-protein interactions. In addition, chemical moieties like protein-based microcrystals, cross-linked enzyme aggregates, and polymer-based nanoreactors have also been discussed in a comprehensive way focusing more on their unique applicability and target-specific actions. Polymer-based nanoreactors are described in detail in vivo together with enhancement of the enzyme stability and controlled function based on the compartmentalization of enzymes. Among the two novel nanoreactor approaches, dendrimers have been exploited as multifunctional enzymatic carriers, while capsomes are designed to regulate poly-enzymatic reactions through intravesicular compartmentalization of a multitude of enzymatic reactions.

Bechi B. et al. Catalytic bio-chemo and bio-bio tandem oxidation reactions for amide and carboxylic acid synthesis // Green Chem. 2014. Vol. 16, № 10. P. 4524–4529.

A catalytic toolbox for three different water-based one-pot cascades to convert aryl alcohols to amides and acids and cyclic amines to lactams, involving combination of oxidative enzymes (monoamine oxidase, xanthine dehydrogenase, galactose oxidase and laccase) and chemical oxidants (TBHP or Cul(cat)/H2O2) at mild temperatures, is presented. Mutually compatible conditions were found to afford products in good to excellent yields.

Bommarius A.S., Blum J.K., Abrahamson M.J. Status of protein engineering for biocatalysts: how to design an industrially useful biocatalyst // Curr. Opin. Chem. Biol. 2011. Vol. 15, № 2. P. 194–200.

Recent advances in the development of both experimental and computational protein engineering tools have enabled a number of further successes in the development of biocatalysts ready for large-scale applications. Key tools are first, the targeting of libraries, leading to far smaller but more useful libraries than in the past, second, the combination of structural, mechanistic, and sequence-based knowledge often based on prior successful cases, and third, the advent of structurally based algorithms allowing the design of novel functions. Based on these tools, a number of improved biocatalysts for pharmaceutical applications have been presented, such as an (R)-transaminase for the synthesis of active pharmaceutical ingredients (APIs) of sitagliptin (Januvia (R)) and ketoreductases, glucose dehydrogenases, and haloalkane dehalogenases for the API synthesis toward atorvastatin (Lipitor (R)) and montelukast (Singulair (R)).

Bornscheuer U. From Commercial Enzymes to Biocatalysts Designed by Protein Engineering // Synlett. 2012. Vol. 24, № 02. P. 150–156.

This account provides a personal view on the development of biocatalysis over the last two decades. Examples include the use of commercial enzymes, such as lipases, (recombinant) esterases, transaminases, and Baeyer–Villiger monooxygenases for the synthesis of optically pure compounds. The opportunity provided by modern protein engineering methods to tailor design an enzyme for a given scientific problem (substrate scope, selectivity, stability) is emphasized together with concepts to boost this technology in terms of timelines and success.

Bornscheuer U.T. et al. Engineering the third wave of biocatalysis // Nature. 2012. Vol. 485, № 7397. P. 185–194.

Over the past ten years, scientific and technological advances have established biocatalysis as a practical and environmentally friendly alternative to traditional metallo- and organocatalysis in chemical synthesis, both in the laboratory and on an industrial scale. Key advances in DNA sequencing and gene synthesis are at the base of tremendous progress in tailoring biocatalysts by protein engineering and design, and the ability to reorganize enzymes into new biosynthetic pathways. To highlight these achievements, here we discuss applications of protein-engineered biocatalysts ranging from commodity chemicals to advanced pharmaceutical intermediates that use enzyme catalysis as a key step.

Brummund J. et al. Dissolving Carbon Dioxide in High Viscous Substrates to Accelerate Biocatalytic Reactions // Biotechnology and Bioengineering. 2011. Vol. 108, № 11. P. 2765–2769.

Solvent free biotransformation of polyglycerol-3 and lauric acid yields polyglycerol-3-laurate and water. This conversion can be catalyzed by Novozym 435. However, the performance is limited by the viscosity of polyglycerol as well as of polyglycerol-3-laurate. A decrease of viscosity by increasing reaction temperature is only possible in a certain temperature range because of the limited stability of the applied enzyme. By dissolving high dense carbon dioxide into the reaction system the viscosity could be reduced, keeping the temperature at an acceptable level at the same time. Thus the reaction rate was increased by a factor of 4 while working at a pressure of 280 bar and 60 degrees C.

Carlsson N. et al. Quantification of protein concentration by the Bradford method in the presence of pharmaceutical polymers // Analytical Biochemistry. 2011. Vol. 411, № 1. P. 116–121.

We investigated how the Bradford assay for measurements of protein released from a drug formulation may be affected by a concomitant release of a pharmaceutical polymer used to formulate the protein delivery device. The main result is that polymer-caused perturbations of the Coomassie dye absorbance at the Bradford monitoring wavelength (595 nm) can be identified and corrected by recording absorption spectra in the region of 350–850 mm. The pharmaceutical polymers Carbopol and chitosan illustrate two potential types of perturbations in the Bradford assay, whereas the third polymer, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), acts as a nonperturbing control. Carbopol increases the apparent absorbance at 595 nm because the polymer aggregates at the low pH of the Bradford protocol, causing a turbidity contribution that can be corrected quantitatively at 595 nm by measuring the sample absorbance at 850 nm outside the dye absorption band. Chitosan is a cationic polymer under Bradford conditions and interacts directly with the anionic Coomassie dye and perturbs its absorption spectrum, including 595 nm. In this case, the Bradford method remains useful if the polymer concentration is known but should be used with caution in release studies where the polymer concentration may vary and needs to be measured independently.

Casey J.P. et al. Versatile de Novo Enzyme Activity in Capsid Proteins from an Engineered M13 Bacteriophage Library // J. Am. Chem. Soc. 2014. Vol. 136, № 47. P. 16508–16514.

Biocatalysis has grown rapidly in recent decades as a solution to the evolving demands of industrial chemical processes. Mounting environmental pressures and shifting supply chains underscore the need for novel chemical activities, while rapid biotechnological progress has greatly increased the utility of enzymatic methods. Enzymes, though capable of high catalytic efficiency and remarkable reaction selectivity, still suffer from relative instability, high costs of scaling, and functional inflexibility. Herein, we developed a biochemical platform for engineering de novo semisynthetic enzymes, functionally modular and widely stable, based on the M13 bacteriophage. The hydrolytic bacteriophage described in this paper catalyzes a range of carboxylic esters, is active from 25 to 80 degrees C, and demonstrates greater efficiency in DMSO than in water. The platform complements biocatalysts with characteristics of heterogeneous catalysis, yielding high-surface area, thermostable biochemical structures readily adaptable to reactions in myriad solvents. As the viral structure ensures semisynthetic enzymes remain linked to the genetic sequences responsible for catalysis, future work will tailor the biocatalysts to high-demand synthetic processes by evolving new activities, utilizing high-throughput screening technology and harnessing M13s multifunctionality.

Currin A. et al. Synthetic biology for the directed evolution of protein biocatalysts: navigating sequence space intelligently // Chem. Soc. Rev. 2015. Vol. 44, № 5. P. 1172–1239.

The amino acid sequence of a protein affects both its structure and its function. Thus, the ability to modify the sequence, and hence the structure and activity, of individual proteins in a systematic way, opens up many opportunities, both scientifically and (as we focus on here) for exploitation in biocatalysis. Modern methods of synthetic biology, whereby increasingly large sequences of DNA can be synthesised de novo, allow an unprecedented ability to engineer proteins with novel functions. However, the number of possible proteins is far too large to test individually, so we need means for navigating the `search space' of possible protein sequences efficiently and reliably in order to find desirable activities and other properties. Enzymologists distinguish binding (K-d) and catalytic (k(cat)) steps. In a similar way, judicious strategies have blended design (for binding, specificity and active site modelling) with the more empirical methods of classical directed evolution (DE) for improving kcat (where natural evolution rarely seeks the highest values), especially with regard to residues distant from the active site and where the functional linkages underpinning enzyme dynamics are both unknown and hard to predict. Epistasis (where the `best' amino acid at one site depends on that or those at others) is a notable feature of directed evolution. The aim of this review is to highlight some of the approaches that are being developed to allow us to use directed evolution to improve enzyme properties, often dramatically. We note that directed evolution differs in a number of ways from natural evolution, including in particular the available mechanisms and the likely selection pressures. Thus, we stress the opportunities afforded by techniques that enable one to map sequence to (structure and) activity in silico, as an effective means of modelling and exploring protein landscapes. Because known landscapes may be assessed and reasoned about as a whole, simultaneously, this offers opportunities for protein improvement not readily available to natural evolution on rapid timescales. Intelligent landscape navigation, informed by sequence-activity relationships and coupled to the emerging methods of synthetic biology, offers scope for the development of novel biocatalysts that are both highly active and robust.

Daniel L. et al. Mechanism-Based Discovery of Novel Substrates of Haloalkane Dehalogenases Using in Silico Screening // J. Chem Inf. Model. 2015. Vol. 55, № 1. P. 54–62.

Substrate specificity is a key feature of enzymes determining their applicability in biomaterials and biotechnologies. Experimental testing of activities with novel substrates is a time-consuming and inefficient process, typically resulting in many failures. Here, we present an experimentally validated in silico method for the discovery of novel substrates of enzymes with a known reaction mechanism. The method was developed for a model system of biotechnologically relevant enzymes, haloalkane dehalogenases. On the basis of the parametrization of six different haloalkane dehalogenases with 30 halogenated substrates, mechanism-based geometric criteria for reactivity approximation were defined. These criteria were subsequently applied to the previously experimentally uncharacterized haloalkane dehalogenase DmmA. The enzyme was computationally screened against 41,366 compounds, yielding 548 structurally unique compounds as potential substrates. Eight out of 16 experimentally tested top-ranking compounds were active with DmmA, indicating a 50% success rate for the prediction of substrates. The remaining eight compounds were able to bind to the active site and inhibit enzymatic activity. These results confirmed good applicability of the method for prioritizing active compoundstrue substrates and bindersfor experimental testing. All validated substrates were large compounds often containing polyaromatic moieties, which have never before been considered as potential substrates for this enzyme family. Whereas four of these novel substrates were specific to DmmA, two substrates showed activity with three other tested haloalkane dehalogenases, i.e., DhaA, DbjA, and LinB. Additional validation of the developed screening strategy with the data set of over 200 known substrates of Candida antarctica lipase B confirmed its applicability for the identification of novel substrates of other biotechnologically relevant enzymes with an available tertiary structure and known reaction mechanism.

Daniel R.M., Danson M.J. A new understanding of how temperature affects the catalytic activity of enzymes // Trends in Biochemical Sciences. 2010. Vol. 35, № 10. P. 584–591.

The two established thermal properties of enzymes are their activation energy and their thermal stability, but experimental data do not match the expectations of these two properties. The recently proposed Equilibrium Model (EM) provides a quantitative explanation of enzyme thermal behaviour under reaction conditions by introducing an inactive (but not denatured) intermediate in rapid equilibrium with the active form. It was formulated as a mathematical model, and fits the known experimental data. Importantly, the EM gives rise to a number of new insights into the molecular basis of the temperature control of enzymes and their environmental adaptation and evolution, it is consistent with active site properties, and it has fundamental implications for enzyme engineering and other areas of biotechnology.

Eriksen D.T., Lian J., Zhao H. Protein design for pathway engineering // Journal of Structural Biology. 2014. Vol. 185, № 2. P. 234–242.

Design and construction of biochemical pathways has increased the complexity of biosynthetically-produced compounds when compared to single enzyme biocatalysis. However, the coordination of multiple enzymes can introduce a complicated set of obstacles to overcome in order to achieve a high titer and yield of the desired compound. Metabolic engineering has made great strides in developing tools to optimize the flux through a target pathway, but the inherent characteristics of a particular enzyme within the pathway can still limit the productivity. Thus, judicious protein design is critical for metabolic and pathway engineering. This review will describe various strategies and examples of applying protein design to pathway engineering to optimize the flux through the pathway. The proteins can be engineered for altered substrate specificity/selectivity, increased catalytic activity, reduced mass transfer limitations through specific protein localization, and reduced substrate/product inhibition. Protein engineering can also be expanded to design biosensors to enable high through-put screening and to customize cell signaling networks. These strategies have successfully engineered pathways for significantly increased productivity of the desired product or in the production of novel compounds.

Faber K., Fessner W.-D., Turner N.J. Engineering Biocatalysts for Synthesis Including Cascade Processes // Advanced Synthesis & Catalysis. 2015. Vol. 357, № 8. P. 1565–1566.

This special issue presents 34 papers from leading researchers in biocatalysis and is comprised of 5 reviews, 6 communications and 23 full papers. The 5 reviews from leading experts in their fields cover emerging topics as diverse as designed cascade reactions, imine reductases, dynamic kinetic resolutions, sialic acid derivatives and creation of artificial metalloenzymes. The original research papers address the entire range of contemporary themes in biocatalysis including new enzyme classes for synthesis as well as methods for their discovery, development and ultimately scale-up and application. As highlighted above, there is an increasing focus on combining two or more enzymes together in a single reaction flask in order to solve challenges ranging from cofactor recycling, in situ racemisation, synthesis of functionalised carbohydrates to in vivo pathway engineering. Readers of this issue will not only gain a timely insight into the current themes and state-of-the-art of this highly dynamic field but may also themselves reflect upon what new challenges the field of biocatalysis should tackle in the next 5 years.

Farwell C.C. et al. Enantioselective Imidation of Sulfides via Enzyme-Catalyzed Intermolecular Nitrogen-Atom Transfer // Journal of the American Chemical Society. 2014. Vol. 136, № 24. P. 8766–8771

Engineering enzymes with novel reaction modes promises to expand the applications of biocatalysis in chem. synthesis and will enhance our understanding of how enzymes acquire new functions. The insertion of nitrogen-?contg. functional groups into unactivated C-?H bonds is not catalyzed by known enzymes but was recently demonstrated using engineered variants of cytochrome P 450BM3 (CYP102A1) from Bacillus megaterium. Here, we extend this novel P 450-?catalyzed reaction to include intermol. insertion of nitrogen into thioethers to form sulfimides. An examn. of the reactivity of different P 450BM3 variants toward a range of substrates demonstrates that electronic properties of the substrates are important in this novel enzyme-?catalyzed reaction. Moreover, amino acid substitutions have a large effect on the rate and stereoselectivity of sulfimidation, demonstrating that the protein plays a key role in detg. reactivity and selectivity. These results provide a stepping stone for engineer

Fessner W.-D. Systems Biocatalysis: Development and engineering of cell-free “artificial metabolisms” for preparative multi-enzymatic synthesis // New Biotechnology. 2015. Vol. 32, № 6. P. 658–664.

Systems Biocatalysis is an emerging concept of organizing enzymes in vitro to construct complex reaction cascades for an efficient, sustainable synthesis of valuable chemical products. The strategy merges the synthetic focus of chemistry with the modular design of biological systems, which is similar to metabolic engineering of cellular production systems but can be realized at a far lower level of complexity from a true reductionist approach. Such operations are free from material erosion by competing metabolic pathways, from kinetic restrictions by physical barriers and regulating circuits, and from toxicity problems with reactive foreign substrates, which are notorious problems in whole-cell systems. A particular advantage of cell-free concepts arises from the inherent opportunity to construct novel biocatalytic reaction systems for the efficient synthesis of non-natural products ("artificial metabolisms") by using enzymes specifically chosen or engineered for non-natural substrate promiscuity. Examples illustrating the technology from our laboratory are discussed.

Friedrich S., Hahn F. Opportunities for enzyme catalysis in natural product chemistry // Tetrahedron. 2015. Vol. 71, № 10. P. 1473–1508.

In this review, we first give a snapshot of established biocatalysts. With respect to the large number of reported examples, we will focus on few representative ones. We will then highlight secondary metabolite biosynthetic pathways regarding their potential to provide useful biocatalysts. Recent progress in biosynthesis research opened up the possibility to tap these pathways as a source for a nearly countless number of new catalysts. We will not cover progress in enzyme engineering and artificial enzymes as these would go beyond the scope of this article. Both have recently been comprehensively reviewed and we would like to refer the reader to the given references.8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 and 20 Examples of engineered biosynthesis enzymes are included and will be explained in the context. This review can of course not be completely comprehensive. Therefore, we apologise in advance to all researchers whose work is not appropriately mentioned. This review addresses both, natural product chemists as well as more biology-oriented scientists.

Gernaey K.V. et al. Application of mechanistic models to fermentation and biocatalysis for next-generation processes // Trends in Biotechnology. 2010. Vol. 28, № 7. P. 346–354.

Mechanistic models are based on deterministic principles, and recently, interest in them has grown substantially. Herein we present an overview of mechanistic models and their applications in biotechnology, including future perspectives. Model utility is highlighted with respect to selection of variables required for measurement, control and process design. In the near future, mechanistic models with a higher degree of detail will play key roles in the development of efficient next-generation fermentation and biocatalytic processes. Moreover, mechanistic models will be used increasingly in the frame of multi-objective decision-making under uncertainty and to promote increased selectivity of products.

Gundersen M.T. et al. Amine donor and acceptor influence on the thermodynamics of omega-transaminase reactions // Tetrahedron-Asymmetry. 2015. Vol. 26, № 10-11. P. 567–570.

In recent years biocatalytic transamination using omega-transaminase has become established as one of the most interesting routes to synthesize chiral amines with a high enantiomeric purity, especially in the pharmaceutical sector where the demand for such compounds is high. Nevertheless, one limitation for successful implementation and scale-up is that the thermodynamics of such conversions are frequently found unfavourable. Herein we report experimental measurements of apparent equilibrium constants for several industrially relevant transamination reactions in a systematic manner to better understand the effect of amine acceptor and donor choice. For example, we have found that ortho-substitution of acetophenone like molecules, had a significant impact on the thermodynamic equilibrium. Likewise, the effect of cyclic amine acceptors was evaluated and compared to similar non-cyclic structures. It was found that an aliphatic six membered ring was favourable and a conjugated bicyclic five membered ring structure, unfavourable. Finally, we evaluated and compared the use of five different donor molecules, and calculated their Delta G(app) values. This is particularly important in the further implementation of such reactions because it may be used to help select suitable donor/acceptor combinations. The results presented here give guidance, with respect to thermodynamics, in order to further extend the application of biocatalytic transamination.

Han F. et al. Bio-Inspired Preparation of Fibrin-Boned Bionanocomposites of Biomacromolecules and Nanomaterials for Biosensing // Advanced Functional Materials. 2014. Vol. 24, № 31. P. 5011–5018.

Learning from nature is one of the most promising ways to develop advanced functional materials. Here, inspired by blood coagulation, novel fibrin-boned bionanocomposites are reported as efficient immobilization matrices of biomacromolecules and nanomaterials for biosensing. Glucose oxidase (GOx), Au nanoparticles (AuNPs), and Fe3O4 magnetic nanoparticles (MNPs) are adopted as the model biomacromolecules and nanomaterials. By integrating the thrombin-triggered coagulation of fibrin with advanced surficial modification techniques, four kinds of immobilization strategies are developed and evaluated. Digital imaging, UV-vis spectroscopy, scanning/transmission electron microscopy, electrochemical methods, and N2 adsorption-desorption isotherms are used to investigate the formation, immobilization efficiency, and performance of various bionanocomposites. The fibrin-boned networks show inherent biocompatibility, excellent adsorbability, porosity, and functionalization ability, endowing the bionanocomposites with high efficiencies in capturing AuNPs, MNPs and GOx (99%, 98%, and 57% captured under the given conditions, respectively), as well as significant mass-transfer and biocatalysis efficiencies. Therefore, the fibrin-boned bionanocomposites show great potential for biosensing, for example, a fibrin-AuNPs-GOx-glutaraldehyde bionanocomposites modified Au electrode is highly sensitive to glucose (145 ?A cm?2 mM?1) allowing for a limit of detection down to 25 nM, being much superior to those of the reported analogues. The presented experimental platform/strategy may find wide applications in the development of other bio/nano-materials/devices.

Hrycay E.G., Bandiera S.M. The monooxygenase, peroxidase, and peroxygenase properties of cytochrome P450 // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2012. Vol. 522, № 2. P. 71–89.

This review examines the monooxygenase, peroxidase, and peroxygenase properties of cytochrome P450 (P450)?1 enzymes and their mechanisms of action in archaeal, bacterial, and mammalian systems. In the P450 catalytic cycle, a transient iron oxo monooxygenating species is generated that reacts with substrate to produce a monooxygenated product. We describe results of early investigations that endeavored to trap and detect this elusive monooxygenating species, as well as results of experiments that attempted to generate and characterize this active oxidant spectroscopically after reacting ferric P450 enzymes with peroxy compounds (e.g. peroxides, peracids) or single oxygen atom donors (e.g. periodate, iodosobenzene)?. Surrogate oxidants were able to promote P450-?catalyzed monooxygenations in a manner similar to that of O2?/NAD(P)?H, suggesting involvement of a common transitory monooxygenating species in the two pathways. This common P450 oxidant was characterized as a porphyrin radical iron(IV) oxo complex and assigned a Compound I structure (Por+FeIV=O) exhibiting a formal FeV oxidation state. Other reactive oxidants, such as the ferric oxenoid complex (PorFeIII=O)?, ferryloxy radical species (PorFeIV-?O·)?, and perferryloxo entity (PorFeV=O)?, were also proposed to function as P450 monooxygenating species.

Humble M.S., Berglund P. Biocatalytic Promiscuity // Eur. J. Org. Chem. 2011. № 19. P. 3391–3401.

Enzymes are attractive catalysts because of their promiscuity and their ability to perform highly regio-, chemo- and stereo-selective transformations. Enzyme promiscuity allows optimisation of industrial processes that require reaction conditions different from those in nature. Many enzymes can be used in reactions completely different from the reaction the enzyme originally evolved to perform. Such catalytically promiscuous reactions can be secondary activities hidden behind a native activity and might be discovered either in screening for that particular activity or, alternatively, by chance. Recently, researchers have designed enzymes to show catalytic promiscuity. It is also possible to design new enzymes from scratch by computer modelling (de novo design), but most work published to date starts from a known enzyme backbone. Promiscuous activity might also be induced or enhanced by rational design or directed evolution (or combinations thereof). Enzyme catalytic promiscuity provides fundamental knowledge about enzyme/substrate interactions and the evolution of new enzymes. New enzymes are required by industry, which needs to optimise chemical processes in an environmentally sustainable way. In this review various aspects of enzyme catalytic promiscuity are considered from a biocatalytic perspective.

Ilie A. et al. P450-catalyzed regio- and stereoselective oxidative hydroxylation of disubstituted cyclohexanes: creation of three centers of chirality in a single CH-activation event // Tetrahedron. 2015. Vol. 71, № 3. P. 470–475.

Wild-type P450-BM3 is able to catalyze in a highly regio- and diastereoselective manner the oxidative hydroxylation of non-activated disubstituted cyclohexane derivatives lacking any functional groups, including cis- and trans-1,2-dimethylcyclohexane, cis- and trans-1,4-dimethylcyclohexane, and trans-1,4-methylisopropylcyclohexane. In all cases except chiral trans-1,2-dimethylcyclohexane as substrate, the single hydroxylation event at a methylene group induces desymmetrization with simultaneous creation of three centers of chirality. Certain mutants increase selectivity, setting the stage for future directed evolution work.

Ji X. et al. Enabling multi-enzyme biocatalysis using coaxial-electrospun hollow nanofibers: redesign of artificial cells // J. Mater. Chem. B. 2014. Vol. 2, № 2. P. 181–190.

Highly efficient immobilization of multi-enzyme systems involving cofactor regeneration represents one of the greatest challenges in bioprocessing. Particulate artificial cells with enzymes and cofactors encapsulated within microcapsules have long been the major type of multi-enzyme biocatalysts. In the present work, a novel hollow nanofiber-based artificial cell that performs multi-step reactions involving efficient coenzyme regeneration was fabricated in situ by a facile co-axial electrospinning process. To that end, a mixture of glycerol and water containing the dissolved multi-enzyme system for the bile acid assay, which included 3?-hydroxysteroid dehydrogenase (3?-HSD), diaphorase (DP) and NADH was fed as the core phase solution, and a N,N-dimethylacetylamide solution of 30 wt% polyurethane was fed as the shell phase solution during the co-axial electrospinning. The relationship between the structures of the hollow nanofibers and the activity and stability of the encapsulated enzymes was studied. At core and shell phase electrospinning solution flow rates of 0.07 and 0.5 mL h?1, activity recoveries as high as 76% and 82% were obtained for the encapsulated 3?-HSD and DP. The hollow nanofiber-based artificial cells were successfully used for the bile acid assay, yielding good linearity for bile acid concentrations ranging from 0–200 ?M. Compared with the solution-based multi-enzyme system, the hollow nanofiber-based multi-enzyme system presented a lumped activity recovery of 75%. In addition, the hollow nanofiber provided the multi-enzyme system confined inside the nano-domain of the hollow fibers with a unique stabilizing mechanism, such that more than a 170-fold increase in half-life at 25 °C was obtained for the encapsulated 3?-HSD and DP. This study is expected to greatly promote and broaden the application of multi-enzyme systems in industry, biosensor, biomedical, and many other related research fields.

Johnston R. et al. Sol-Generating Chemical Vapor into Liquid (SG-CViL) deposition – a facile method for encapsulation of diverse cell types in silica matrices // J. Mater. Chem. B. 2015. Vol. 3, № 6. P. 1032–1041.

In nature, cells perform a variety of complex functions such as sensing, catalysis, and energy conversion which hold great potential for biotechnological device construction. However, cellular sensitivity to ex vivo environments necessitates development of bio–nano interfaces which allow integration of cells into devices and maintain their desired functionality. In order to develop such an interface, the use of a novel Sol-Generating Chemical Vapor into Liquid (SG-CViL) deposition process for whole cell encapsulation in silica was explored. In SG-CViL, the high vapor pressure of tetramethyl orthosilicate (TMOS) is utilized to deliver silica into an aqueous medium, creating a silica sol. Cells are then mixed with the resulting silica sol, facilitating encapsulation of cells in silica while minimizing cell contact with the cytotoxic products of silica generating reactions (i.e. methanol), and reduce exposure of cells to compressive stresses induced from silica condensation reactions. Using SG-CVIL, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) engineered with an inducible beta galactosidase system were encapsulated in silica solids and remained both viable and responsive 29 days post encapsulation. By tuning SG-CViL parameters, thin layer silica deposition on mammalian HeLa and U87 human cancer cells was also achieved. The ability to encapsulate various cell types in either a multi cell (S. cerevisiae) or a thin layer (HeLa and U87 cells) fashion shows the promise of SG-CViL as an encapsulation strategy for generating cell–silica constructs with diverse functions for incorporation into devices for sensing, bioelectronics, biocatalysis, and biofuel applications.

Kamerlin S.C.L., Warshel A. At the dawn of the 21st century: Is dynamics the missing link for understanding enzyme catalysis? // Proteins. 2010. Vol. 78, № 6. P. 1339–1375.

Enzymes play a key role in almost all biological processes, accelerating a variety of metabolic reactions as well as controlling energy transduction, the transcription, and translation of genetic information, and signaling. They possess the remarkable capacity to accelerate reactions by many orders of magnitude compared to their uncatalyzed counterparts, making feasible crucial processes that would otherwise not occur on biologically relevant timescales. Thus, there is broad interest in understanding the catalytic power of enzymes on a molecular level. Several proposals have been put forward to try to explain this phenomenon, and one that has rapidly gained momentum in recent years is the idea that enzyme dynamics somehow contributes to catalysis. This review examines the dynamical proposal in a critical way, considering basically all reasonable definitions, including (but not limited to) such proposed effects as "coupling between conformational and chemical motions," "landscape searches" and "entropy funnels." It is shown that none of these proposed effects have been experimentally demonstrated to contribute to catalysis, nor are they supported by consistent theoretical studies. On the other hand, it is clarified that careful simulation studies have excluded most (if not all) dynamical proposals. This review places significant emphasis on clarifying the role of logical definitions of different catalytic proposals, and on the need for a clear formulation in terms of the assumed potential surface and reaction coordinate. Finally, it is pointed out that electrostatic preorganization actually accounts for the observed catalytic effects of enzymes, through the corresponding changes in the activation free energies.

Kannan K., Mukherjee J., Gupta M.N. Immobilization of a Lipase on Mesocellular Foam of Silica for Biocatalysis in Low-water-containing Organic Solvents // Chemistry Letters. 2014. Vol. 43, № 7. P. 1064–1066.

Unfunctionalized mesocellular foam of silica was used for immobilization of the lipase from Thermomyces lanuginosus. In the first approach, lipase was adsorbed onto polyethyleneimine-coated Fe3O4 nanoparticles, and these particles in turn were bound to the foam interior to obtain the immobilized preparation [(PEI–Fe3O4)–TLL]–MCF. In the second method, PEI-coated Fe3O4 nanoparticles were bound to the foam, and the lipase was bound to the composite to obtain [MCF–(PEI–Fe3O4)]–TLL as the immobilized preparation. The second preparation was found to be better in terms of surface area (397 m2 g?1), pore diameter (112 A), and total pore volume (2.5 cm3 g?1). This preparation also performed better for synthesis of hexyl butyrate and biodiesel.

Kim B. et al. Combinatorial Design of a Highly Efficient Xylose-Utilizing Pathway in Saccharomyces cerevisiae for the Production of Cellulosic Biofuels // Applied and Environmental Microbiology. 2013. Vol. 79, № 3. P. 931–941.

Balancing the flux of a heterologous metabolic pathway by tuning the expression and properties of the pathway enzymes is difficult, but it is critical to realizing the full potential of microbial biotechnology. One prominent example is the metabolic engineering of a Saccharomyces cerevisiae strain harboring a heterologous xylose-utilizing pathway for cellulosic-biofuel production, which remains a challenge even after decades of research. Here, we developed a combinatorial pathway-engineering approach to rapidly create a highly efficient xylose-utilizing pathway for ethanol production by exploring various combinations of enzyme homologues with different properties. A library of more than 8,000 xylose utilization pathways was generated using DNA assembler, followed by multitiered screening, which led to the identification of a number of strain-specific combinations of the enzymes for efficient conversion of xylose to ethanol. The balancing of metabolic flux through the xylose utilization pathway was demonstrated by a complete reversal of the major product from xylitol to ethanol with a similar yield and total by-product formation as low as 0.06 g/g xylose without compromising cell growth. The results also suggested that an optimal enzyme combination depends on not only the genotype/phenotype of the host strain, but also the sugar composition of the fermentation medium. This combinatorial approach should be applicable to any heterologous pathway and will be instrumental in the optimization of industrial production of value-added products.

Larion M., Miller B.G. Homotropic allosteric regulation in monomeric mammalian glucokinase // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2012. Vol. 519, № 2. P. 103–111.

Glucokinase catalyzes the ATP-dependent phosphorylation of glucose, a chemical transformation that represents the rate-limiting step of glycolytic metabolism in the liver and pancreas. Glucokinase is a central regulator of glucose homeostasis as evidenced by its association with two disease states, maturity onset diabetes of the young (MODY) and persistent hyperinsulinemia of infancy (PHHI). Mammalian glucokinase is subject to homotropic allosteric regulation by glucose-the steady-state velocity of glucose-6-phosphate production is not hyperbolic, but instead displays a sigmoidal response to increasing glucose concentrations. The positive cooperativity displayed by glucokinase is intriguing since the enzyme functions as a monomer under physiological conditions and contains only a single binding site for glucose. Despite the existence of several models of kinetic cooperativity in monomeric enzymes, a consensus has yet to be reached regarding the mechanism of allosteric regulation in glucokinase. Experimental evidence collected over the last 45 years by a number of investigators supports a link between cooperativity and slow conformational reorganizations of the glucokinase scaffold. In this review, we summarize advances in our understanding of glucokinase allosteric regulation resulting from recent X-ray crystallographic, pre-equilibrium kinetic and high-resolution nuclear magnetic resonance investigations. We conclude with a brief discussion of unanswered questions regarding the mechanistic basis of kinetic cooperativity in mammalian glucokinase.

Lavrov K.V., Larikova G.A., Yanenko A.S. Novel biocatalytic process of N-substituted acrylamide synthesis // Appl Biochem Microbiol. 2013. Vol. 49, № 8. P. 702–705.

The enzymatic synthesis of N-substituted acrylamides (N-isopropyl acrylamide and N, N-dimethylaminopropyl acrylamide) was demonstrated for the first time. The Rhodococcus erythropolis 37 strain, exhibiting acylamidase activity, was used as a source of enzyme, and water-dissolved acrylamide and isopropylamine/dimethylaminopropylamine served as substrates. The optimum conditions for the synthesis of acrylamide N-substitutes were determined using N-isopropyl acrylamide. The yield of the product was maximum at pH 9.5–10.5, substrate (acrylamide/isopropylamine) ratio within the range from 1.3: 1 to 2: 1, and absolute substrate concentrations of 8.0 (acrylamide) and 4.0% (isopropylamine). These conditions allowed for the synthesis of 22 g/L of N-isopropyl acrylamide.

Loncar N., Fraaije M.W. Catalases as biocatalysts in technical applications: current state and perspectives // Applied Microbiology and Biotechnology. 2015. Vol. 99, № 8. P. 3351–3357.

Catalases represent a class of enzymes which has found its place among industrially relevant biocatalysts due to their exceptional catalytic rate and high stability. Textile bleaching prior to the dyeing process is the main application and has been performed on a large scale for the past few decades. Their limited substrate scope has not prevented the development of various other catalase-based applications. Newly developed approaches continue to exploit their excellent catalytic potential to degrade hydrogen peroxide while (per)oxidase activity of catalases is opening a new range of possibilities as well. This review provides an overview of applications that involve heme-containing catalases that have been demonstrated in recent years.

McMahon M.D., Prather K.L.J. Functional Screening and In Vitro Analysis Reveal Thioesterases with Enhanced Substrate Specificity Profiles That Improve Short-Chain Fatty Acid Production in Escherichia coli // Applied and Environmental Microbiology. 2014. Vol. 80, № 3. P. 1042–1050.

Short-chain fatty acid (SCFA) biosynthesis is pertinent to production of biofuels, industrial compounds, and pharmaceuticals from renewable resources. To expand on Escherichia coli SCFA products, we previously implemented a coenzyme A (CoA)-dependent pathway that condenses acetyl-CoA to a diverse group of short-chain fatty acyl-CoAs. To increase product titers and reduce premature pathway termination products, we conducted in vivo and in vitro analyses to understand and improve the specificity of the acyl-CoA thioesterase enzyme, which releases fatty acids from CoA. A total of 62 putative bacterial thioesterases, including 23 from the cow rumen microbiome, were inserted into a pathway that condenses acetyl-CoA to an acyl-CoA molecule derived from exogenously provided propionic or isobutyric acid. Functional screening revealed thioesterases that increase production of saturated (valerate), unsaturated (trans-2-pentenoate), and branched (4-methylvalerate) SCFAs compared to overexpression of E. coli thioesterase tesB or native expression of endogenous thioesterases. To determine if altered thioesterase acyl-CoA substrate specificity caused the increase in product titers, six of the most promising enzymes were analyzed in vitro. Biochemical assays revealed that the most productive thioesterases rely on promiscuous activity but have greater specificity for product-associated acyl-CoAs than for precursor acyl-CoAs. In this study, we introduce novel thioesterases with improved specificity for saturated, branched, and unsaturated short-chain acyl-CoAs, thereby expanding the diversity of potential fatty acid products while increasing titers of current products. The growing uncertainty associated with protein database annotations denotes this study as a model for isolating functional biochemical pathway enzymes in situations where experimental evidence of enzyme function is absent.

Mironov G.G. et al. Bioanalysis for Biocatalysis: Multiplexed Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry Assay for Aminotransferase Substrate Discovery and Specificity Profiling // Journal of the American Chemical Society. 2013. Vol. 135, № 37. P. 13728–13736.

In this work, we introduce an entirely automated enzyme assay based on capillary electrophoresis coupled to electrospray ionization mass spectrometry termed MINISEP-MS for multiple interfluent nanoinjections–incubation–separation–enzyme profiling using mass spectrometry. MINISEP-MS requires only nanoliters of reagent solutions and uses the separation capillary as a microreactor, allowing multiple substrates to be assayed simultaneously. The method can be used to rapidly profile the substrate specificity of any enzyme and to measure steady-state kinetics in an automated fashion. We used the MINISEP-MS assay to profile the substrate specificity of three aminotransferases (E. coli aspartate aminotransferase, E. coli branched-chain amino acid aminotransferase, and Bacillus sp. YM-1 d-amino acid aminotransferase) for 33 potential amino acid substrates and to measure steady-state kinetics. Using MINISEP-MS, we were able to recapitulate the known substrate specificities and to discover new amino acid substrates for these industrially relevant enzymes. Additionally, we were able to measure the apparent KM and kcat parameters for amino acid donor substrates of these aminotransferases. Because of its many advantages, the MINISEP-MS assay has the potential of becoming a useful tool for researchers aiming to identify or create novel enzymes for specific biocatalytic applications.

Mishra A., Sardar M. Cellulase assisted synthesis of nano-silver and gold: Application as immobilization matrix for biocatalysis // International Journal of Biological Macromolecules. 2015. Vol. 77. P. 105–113.

In the present study, we report in vitro synthesis of silver and gold nanoparticles (NPs) using cellulase enzyme in a single step reaction. Synthesized nanoparticles were characterized by UV–VIS spectroscopy, Dynamic Light Spectroscopy (DLS), Transmission Electron Microscopy (TEM), Energy-dispersive X-ray Spectroscopy (EDX), X-ray Diffraction (XRD), Circular Dichroism (CD) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). UV–visible studies shows absorption band at 415 nm and 520 nm for silver and gold NPs respectively due to surface plasmon resonance. Sizes of NPs as shown by TEM are 5–25 nm for silver and 5–20 nm for gold. XRD peaks confirmed about phase purity and crystallinity of silver and gold NPs. FTIR data shows presence of amide I peak on both the NPs. The cellulase assisted synthesized NPs were further exploited as immobilization matrix for cellulase enzyme. Thermal stability analysis reveals that the immobilized cellulase on synthesized NPs retained 77–80% activity as compared to free enzyme. While reusability data suggests immobilized cellulase can be efficiently used up to sixth cycles with minimum loss of enzyme activity. The secondary structural analysis of cellulase enzyme during the synthesis of NPs and also after immobilization of cellulase on these NPs was carried out by CD spectroscopy.

Nair N.U., Denard C.A., Zhao H. Engineering of Enzymes for Selective Catalysis // Curr. Org. Chem. 2010. Vol. 14, № 17. P. 1870–1882.

Naturally occurring enzymes are truly remarkable catalysts. However, many are not suitable for practical synthetic chemistry because of poor substrate or product selectivity. This review highlights recent advances in engineering enzymes for selective catalysis. Selected topics include altering substrate specificity, altering substrate and product selectivity, engineering enzymes that catalyze carbon-carbon bond formation or carbon-oxygen bond cleavage and formation, and engineering multi-function enzymes such as polyketide synthases.

Palomo J.M. Click-Chemistry in Biocatalysis // Current Organic Chemistry. 2013. Vol. 17, № 7. P. 691–700.

The application of specific chemical strategies to alter the structure of enzymes in order to improve their catalytic properties in different biotransformations has been a central role in biocatalysis in recent years. Particularly, cycloaddition reactions have represented a successfully methodology for enzyme chemistry because it is chemoselective and extremely rate-accelerated in aqueous media. Some of the most current examples in the use of click chemistry for site-specific modification and immobilization of enzymes has been reviewed in the present article.

Peng H.-P. et al. General preparation of novel core–shell heme protein–Au–polydopamine–Fe3O4 magnetic bionanoparticles for direct electrochemistry // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2013. Vol. 700. P. 70–76.

Inspired by adhesive proteins secreted by mussels, a general biomolecule immobilization approach has been proposed to the synthesis of multifunctional core–shell heme protein–Au–polydopamine–Fe3O4 magnetic bionanoparticles (heme protein–Au–PDA–Fe3O4 MBNPs) using one-pot chemical polymerization. Scanning electron microscope, energy dispersive X-ray spectrometer, UV–vis spectroscopy, and electrochemical methods were used to characterize the heme protein–Au–PDA–Fe3O4 MBNPs. Results demonstrated that the resultant MBNPs not only had the magnetism of Fe3O4 nanoparticles which made them easily manipulated by an external magnetic field, but also had the excellent biocompatibility and good conductivity of PDA and Au nanoparticles which could maintain the native structure of the heme proteins, and facilitated the direct electrochemistry of heme proteins including hemoglobin (Hb), myoglobin (Mb) and horseradish peroxidase (HRP) in the biofilm. Hence, the protein–Au–PDA–Fe3O4 biofilm electrode displayed excellent catalytic performance for H2O2. This facile, versatile, and inexpensive proteins immobilization platform is promising for the preparation of many other MBNPs with interesting properties and application potentials in many fields, such as biosensing, biocatalysis, biofuel cells, and bioaffinity separation.

Perez-Sanchez M. et al. Biocatalysis in Biomass-derived Solvents: The Quest for Fully Sustainable Chemical Processes // Current Organic Chemistry. 2013. Vol. 17, № 11. P. 1188–1199.

A review. The use of biocatalysis for the provision of optically active building blocks and other useful compds. for fine chems. and pharmaceutical industries is nowadays a mature technol. To further improve the ecol. footprints of these applications, there is currently an increasing interest in using biomass-?derived solvents for enzyme-?catalyzed processes that may be implemented at industrial level on a midterm basis. The rationale behind these concepts would be the final replacement of petroleum-?based solvents by more benign, environmentally-?friendly, biodegradable, tunable and smart solvents. This review discusses the state-?of-?the-?art on this topic, focusing on recent enzymic applications reported in deep-?eutectic-?solvents, 2-?methyltetrahydrofuran, glycerol-?based solvents, and org. carbonates, among some important relevant cases of biomass-?derived solvents from which biocatalytic applications were assessed. When possible, the connection of these emerging applications with pharmaceutical chem. will be provided as well.

Reetz M.T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future // J. Am. Chem. Soc. 2013. Vol. 135, № 34. P. 12480–12496.

Enzymes as catalysts in synthetic organic chemistry gained importance in the latter half of the 20th century, but nevertheless suffered from two major limitations. First, many enzymes were not accessible in large enough quantities for practical applications. The advent of recombinant DNA technology changed this dramatically in the late 1970s. Second, many enzymes showed a narrow substrate scope, often poor stereo- and/or regioselectivity and/or insufficient stability under operating conditions. With the development of directed evolution beginning in the 1990s and continuing to the present day, all of these problems can be addressed and generally solved. The present Perspective focuses on these and other developments which have popularized enzymes as part of the toolkit of synthetic organic chemists and biotechnologists. Included is a discussion of the scope and limitation of cascade reactions using enzyme mixtures in vitro and of metabolic engineering of pathways in cells as factories for the production of simple compounds such as biofuels and complex natural products. Future trends and problems are also highlighted, as is the discussion concerning biocatalysis versus nonbiological catalysis in synthetic organic chemistry. This Perspective does not constitute a comprehensive review, and therefore the author apologizes to those researchers whose work is not specifically treated here.

Rodrigues R.C. et al. Amination of enzymes to improve biocatalyst performance: coupling genetic modification and physicochemical tools // RSC Adv. 2014. Vol. 4, № 72. P. 38350–38374.

Improvement of the features of an enzyme is in many instances a pre-requisite for the industrial implementation of these exceedingly interesting biocatalysts. To reach this goal, the researcher may utilize different tools. For example, amination of the enzyme surface produces an alteration of the isoelectric point of the protein along with its chemical reactivity (primary amino groups are the most widely used to obtain the reaction of the enzyme with surfaces, chemical modifiers, etc.) and even its "in vivo" behavior. This review will show some examples of chemical (mainly modifying the carboxylic groups using the carbodiimide route), physical (using polycationic polymers like polyethyleneimine) and genetic amination of the enzyme surface. Special emphasis will be put on cases where the amination is performed to improve subsequent protein modifications. Thus, amination has been used to increase the intensity of the enzyme/support multipoint covalent attachment, to improve the interaction with cation exchanger supports or polymers, or to promote the formation of crosslinkings (both intra-molecular and in the production of crosslinked enzyme aggregates). In other cases, amination has been used to directly modulate the enzyme properties (both in immobilized or free form). Amination of the enzyme surface may also pursue other goals not related to biocatalysis. For example, it has been used to improve the raising of antibodies against different compounds (both increasing the number of haptamers per enzyme and the immunogenicity of the composite) or the ability to penetrate cell membranes. Thus, amination may be a very powerful tool to improve the use of enzymes and proteins in many different areas and a great expansion of its usage may be expected in the near future.

Roiban G.-D., Reetz M.T. Expanding the toolbox of organic chemists: directed evolution of P450 monooxygenases as catalysts in regio- and stereoselective oxidative hydroxylation // Chem. Commun. 2015. Vol. 51, № 12. P. 2208–2224.

Cytochrome P450 enzymes (CYPs) have been used for more than six decades as catalysts for the CH-activating oxidative hydroxylation of organic compounds with formation of added-value products. However, it has not been possible to control regio- and stereoselectivity in a general manner, which is necessary for wide (industrial) applications. Especially directed evolution as a Darwinian approach to protein engineering has changed the situation for the better during the last 3-4 years leading to extensive progress, which is summarized and analysed in this Feature Article.

Romano D. et al. Esterases as stereoselective biocatalysts // Biotechnology Advances. 2015. Vol. 33, № 5. P. 547–565.

Non-lypolitic esterases are carboxylester hydrolases with preference for the hydrolysis of water-soluble esters bearing short-chain acyl residues. The potential of esterases as enantioselective biocatalysts has enlarged in the last few years due to the progresses achieved in different areas, such as screening methodologies, overproduction of recombinant esterases, structural information useful for understanding the rational behind enantioselectivity, and efficient methods in protein engineering. Contributions of these complementary know-hows to the development of new robust enantioselective esterases are critically discussed in this review.

Roos G., Geerlings P., Messens J. Enzymatic Catalysis: The Emerging Role of Conceptual Density Functional Theory // Journal of Physical Chemistry B. 2009. Vol. 113, № 41. P. 13465–13475.

Experimentalists and quantum chemists are living in a different world. A wealth of theoretical enzymology-related publications is hardly known by experimentalists, and vice versa. Our aim is to bring both worlds together and to show the powerful possibilities of a multidisciplinary approach to study Subtle details of complicated enzymatic processes to a broad readership. MD simulations and QM/MM approaches often focus on the calculation of reaction paths based on activation energies, which is a time-consuming task. A valuable alternative is the reactivity descriptors founded in conceptual DFT like softness, electrophilicity, and the Fukui function, which describe the kinetic aspects of a reaction in terms of the response to perturbations in N and/or v(r), typical for a chemical reaction, of the reagents in the ground state. As such, the relative energies at the beginning of the reaction predict a sequence of activation energies only based on the properties of the reactants (Figure 5). In 2003, Geerlings et al. published a key review giving a detailed description of the principles and concepts of conceptual DFT and highlighting its success to study generalized acid/base reactions including addition, substitution, and elimination reactions. Since the time that this review appeared, conceptual DFT has proven its strength in literally hundreds of papers with application to organic and inorganic reactions. Its role in unravelling enzymatic reaction mechanisms, in handling experimentally difficult accessible biochemical problems, and in the interpretation of biochemical experimental observations is emerging and very promising.

Savile C.K. et al. Biocatalytic Asymmetric Synthesis of Chiral Amines from Ketones Applied to Sitagliptin Manufacture // Science. 2010. Vol. 329, № 5989. P. 305–309.

Pharmaceutical synthesis can benefit greatly from the selectivity gains associated with enzymatic catalysis. Here, we report an efficient biocatalytic process to replace a recently implemented rhodium-catalyzed asymmetric enamine hydrogenation for the large-scale manufacture of the antidiabetic compound sitagliptin. Starting from an enzyme that had the catalytic machinery to perform the desired chemistry but lacked any activity toward the prositagliptin ketone, we applied a substrate walking, modeling, and mutation approach to create a transaminase with marginal activity for the synthesis of the chiral amine; this variant was then further engineered via directed evolution for practical application in a manufacturing setting. The resultant biocatalysts showed broad applicability toward the synthesis of chiral amines that previously were accessible only via resolution. This work underscores the maturation of biocatalysis to enable efficient, economical, and environmentally benign processes for the manufacture of pharmaceuticals.

Schueuermann J. et al. Bacterial whole-cell biocatalysts by surface display of enzymes: toward industrial application // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014. Vol. 98, № 19. P. 8031–8046.

Despite the first report on the bacterial display of a recombinant peptide appeared almost 30 years ago, industrial application of cells with surface-displayed enzymes is still limited. To display an enzyme on the surface of a living cell bears several advantages. First of all, neither the substrate nor the product of the enzymatic reaction needs to cross a membrane barrier. Second, the enzyme being linked to the cell can be separated from the reaction mixture and hence the product by simple centrifugation. Transfer to a new substrate preparation results in multiple cycles of enzymatic conversion. Finally, the anchoring in a matrix, in this case, the cell envelope stabilizes the enzyme and makes it less accessible to proteolytic degradation and material adsorption resulting in continuous higher activities. These advantages in common need to balance some disadvantages before this application can be taken into account for industrial processes, e.g., the exclusion of the enzyme from the cellular metabolome and hence from redox factors or other co-factors that need to be supplied. Therefore, this digest describes the different systems in Gram-positive and Gram-negative bacteria that have been used for the surface display of enzymes so far and focuses on examples among these which are suitable for industrial purposes or for the production of valuable resources, not least in order to encourage a broader application of whole-cell biocatalysts with surface-displayed enzymes.

Schulenburg C., Miller B.G. Enzyme Recruitment and Its Role in Metabolic Expansion // Biochemistry. 2014. Vol. 53, № 5. P. 836–845.

Although more than 10(9) years have passed since the existence of the last universal common ancestor, proteins have yet to reach the limits of divergence. As a result, metabolic complexity is ever expanding. Identifying and understanding the mechanisms that drive and limit the divergence of protein sequence space impact not only evolutionary biologists investigating molecular evolution but engineer novel metabolic pathways. Investigations over the past SO years indicate that the recruitment of enzymes for new functions is a key event in the acquisition of new metabolic capacity. In this review, we outline the genetic mechanisms that enable recruitment and summarize the present state of knowledge regarding the functional characteristics of extant catalysts that facilitate recruitment. We also highlight recent examples of enzyme recruitment, both from the historical record provided by phylogenetics and from enzyme evolution experiments. We conclude with a look to the future, which promises fruitful consequences from the convergence of molecular evolutionary theory, laboratory-directed evolution, and synthetic biology.

Sigrist R. et al. Nature-inspired enzymatic cascades to build valuable compounds // Biotechnology Advances. 2015. Vol. 33, № 5. P. 394–411.

Biocatalysis currently is focusing on enzymatic and multi-enzymatic cascade processes instead of single steps imbedded into chemical pathways. Alongside this scientific revolution, this review provides an overview on multi-enzymatic cascades that are responsible for the biosynthesis of some terpenes, alkaloids and polyethers, which are important classes of natural products. Herein, we illustrate the development of studies inspired by multi- and chemo-enzymatic approaches to build the core moieties of polyethers, polypeptide alkaloids, piperidines and pyrrolidines promoted by the joint action of oxidoreductases, hydrolases, cyclases, transaminases and imine reductases.

Silakov A. et al. Characterization of a Cross-Linked Protein Nucleic Acid Substrate Radical in the Reaction Catalyzed by RlmN // Journal of the American Chemical Society. 2014. Vol. 136, № 23. P. 8221–8228.

RlmN and Cfr are methyltransferases?/methylsynthases that belong to the radical S-?adenosylmethionine superfamily of enzymes. RlmN catalyzes C2 methylation of adenosine 2503 (A2503) of 23S rRNA, while Cfr catalyzes C8 methylation of the exact same nucleotide, and will subsequently catalyze C2 methylation if the site is unmethylated. A key feature of the unusual mechanisms of catalysis proposed for these enzymes is the attack of a methylene radical, derived from a methylcysteine residue, onto the carbon center undergoing methylation to generate a paramagnetic protein-?nucleic acid cross-?linked species. This species has been thoroughly characterized during Cfr-?dependent C8 methylation, but does not accumulate to detectible levels in RlmN-?dependent C2 methylation. Herein, we show that inactive C118S?/A variants of RlmN accumulate a substrate-?derived paramagnetic species. Characterization of this species by electron paramagnetic resonance spectroscopy in concert with strategic isotopic labeling shows that the radical is delocalized throughout the adenine ring of A2503, although predominant spin density is on N1 and N3. Moreover, (13)?C hyperfine interactions between the radical and the methylene carbon of the formerly [methyl-?(13)?C]?Cys355 residue show that the radical species exists in a covalent cross-?link between the protein and the nucleic acid substrate. X-?ray structures of RlmN C118A show that, in the presence of SAM, the substitution does not alter the active site structure compared to that of the wild-?type enzyme. Together, these findings have new mechanistic implications for the role(s) of C118 and its counterpart in Cfr (C105) in catalysis, and suggest involvement of the residue in resolution of the cross-?linked species via a radical mediated process.

Solomon K.V., Sanders T.M., Prather K.L.J. A dynamic metabolite valve for the control of central carbon metabolism // Metabolic Engineering. 2012. Vol. 14, № 6. P. 661–671.

Successful redirection of endogenous resources into heterologous pathways is a central tenet in the creation of efficient microbial cell factories. This redirection, however, may come at a price of poor biomass accumulation, reduced cofactor regeneration and low recombinant enzyme expression. In this study, we propose a metabolite valve to mitigate these issues by dynamically tuning endogenous processes to balance the demands of cell health and pathway efficiency. A control node of glucose utilization, glucokinase (Glk), was exogenously manipulated through either engineered antisense RNA or an inverting gene circuit. Using these techniques, we were able to directly control glycolytic flux, reducing the specific growth rate of engineered Escherichia coli by up to 50% without altering final biomass accumulation. This modulation was accompanied by successful redirection of glucose into a model pathway leading to an increase in the pathway yield and reduced carbon waste to acetate. This work represents one of the first examples of the dynamic redirection of glucose away from central carbon metabolism and enables the creation of novel, efficient intracellular pathways with glucose used directly as a substrate.

Stryjewska A. et al. Biotechnology and genetic engineering in the new drug development. Part III. Biocatalysis, metabolic engineering and molecular modelling // Pharmacological Reports. 2013. Vol. 65, № 5. P. 1102–1111.

Industrial biotechnology has been defined as the use and application of biotechnology for the sustainable processing and production of chemicals, materials and fuels. It makes use of biocatalysts such as microbial communities, whole-cell microorganisms or purified enzymes. In the review these processes are described. Drug design is an iterative process which begins when a chemist identifies a compound that displays an interesting biological profile and ends when both the activity profile and the chemical synthesis of the new chemical entity are optimized. Traditional approaches to drug discovery rely on a stepwise synthesis and screening program for large numbers of compounds to optimize activity profiles. Over the past ten to twenty years, scientists have used computer models of new chemical entities to help define activity profiles, geometries and relativities. This article introduces inter alia the concepts of molecular modelling and contains references for further reading.

Toney M.D. Controlling reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes // Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics. 2011. Vol. 1814, № 11. P. 1407–1418.

Pyridoxal 5'-?phosphate enzymes are ubiquitous in the nitrogen metabolism of all organisms. They catalyze a wide variety of reactions including racemization, transamination, decarboxylation, elimination, retro-?aldol cleavage, Claisen condensation, and others on substrates containing an amino group, most commonly ?-?amino acids. The wide variety of reactions catalyzed by PLP enzymes is enabled by the ability of the covalent aldimine intermediate formed between substrate and PLP to stabilize carbanionic intermediates at C? of the substrate. This revie+J25w attempts to summarize the mechanisms by which reaction specificity can be achieved in PLP enzymes by focusing on three aspects of these reactions: stereoelectronic effects, protonation state of the external aldimine intermediate, and interaction of the carbanionic intermediate with the protein side chains present in the active site. This article is part of a Special Issue entitled: Pyridoxal Phosphate Enzymology.

Torrelo G., Hanefeld U., Hollmann F. Biocatalysis // Catal. Lett. 2015. Vol. 145, № 1. P. 309–345.

Biocatalysis is an enabling technology for chemists. Using isolated enzymes or whole cells gives access to a broad range of selective transformations-often inaccessible with 'chemical' catalysts. This contribution tries to summarize the present state-of-the-art in biocatalysis.

Toure B.B., Hall D.G. Natural Product Synthesis Using Multicomponent Reaction Strategies // Chem. Rev. 2009. Vol. 109, № 9. P. 4439–4486.

In lieu of an abstract, this is the article's first page

Trincone A. Biocatalytic Processes Using Marine Biocatalysts: Ten Cases in Point // Current Organic Chemistry. 2013. Vol. 17, № 10. P. 1058–1066.

A review. The adaptation of marine organisms to a wide range of environmental conditions in the specific environment (temp., salinity, tides, pressure, radiation, light, etc.) has made them an enormous reservoir of interesting biol. material for both basic research and biotechnol. improvements. Both this evolutionary richness and the knowledge of enzyme action including the comprehension of interactive effects of the environmental factors, are of key importance to exploit biocatalyst's potential. But above all a marine enzyme may carry novel chem. and stereochem. properties thus biocatalytically oriented studies (testing of suitable substrates, appropriate checking of reaction conditions, study of stereochem. asset of catalysis) should be performed to appropriately reveal this "chem. biodiversity". In this review article, comparing among enzymes from terrestrial and marine environments, ten cases in point will be depicted after general considerations on marine organisms and marine biocatalysts. Each case has been selected for its importance related to the field of biocatalysis, showing practical details to value the concept of potential usefulness of marine enzymes for org. chemists. From this anal. a foresight regarding the strategic potential of marine habitat resulted clear. Sustainability of collection methods and availability of com. fresh organisms are two important aspects, also in relation to international policy on biodiversity. As early as scientific interest arise, possibly the way to access useful biocatalysts should avoid destructive large-?scale collections of marine enzymes for org. chemists. From this anal. a foresight regarding the strategic potential of marine habitat resulted clear. Sustainability of collection methods and availability of com. fresh organisms are two important aspects, also in relation to international policy on biodiversity.

Tufvesson P. et al. Economic Considerations for Selecting an Amine Donor in Biocatalytic Transamination // Organic Process Research & Development. 2015. Vol. 19, № 6. P. 652–660.

The industrial implementation of biocatalysis for production of pharma and fine chemicals has grown substantially over recent years. An upcoming application is that of chiral synthesis of optically pure amines, a technology known for many years but that is now seeing a renewed and wider interest in industry. The technology has been demonstrated in a few selected cases, but widespread implementation and for a broader range of target molecules requires a deeper understanding of the underlying thermodynamic as well as economic constraints for the different choices that can be made in designing the process, in particular the choice of amine donor. This paper discusses these constraints and demonstrates, through simple thermodynamic and economic models, the process targets that need to be set and achieved for a process dependent on allowed process costs and quality targets.

Urlacher V.B., Girhard M. Cytochrome P450 monooxygenases: an update on perspectives for synthetic application // Trends in Biotechnology. 2012. Vol. 30, № 1. P. 26–36.

Cytochrome P450 monooxygenases (P450s) are versatile biocatalysts that catalyze the regio- and stereospeci?c oxidation of non-activated hydrocarbons under mild conditions, which is a challenging task for chemical catalysts. Over the past decade impressive advances have been achieved via protein engineering with regard to activity, stability and specificity of P450s. In addition, a large pool of newly annotated P450s has attracted much attention as a source for novel biocatalysts for oxidation. In this review we give a short up-to-date overview of recent results on P450 engineering for technical applications including aspects of whole-cell biocatalysis with engineered recombinant enzymes. Furthermore, we focus on recently identified P450s with novel biotechnologically relevant properties.

Wang M. et al. Advances in carrier-bound and carrier-free immobilized nanobiocatalysts // Chemical Engineering Science. 2015. Vol. 135. P. 21–32.

Although the immobilization of enzymes with improved activity and stability has been the subject of growing interest for many years, new opportunities arose by implementing nanomaterials as immobilizing carriers. The nano-carriers not only offer larger surface area and lower mass-transfer limitation but also endow the native enzyme with specific performances due to their various physical or chemical properties. A carrier-free nanobiocatalyst, cross-linked enzyme aggregates (CLEAs), has been developed for applications in industrial bioprocesses. This review illustrates the recent achievements in nanobiocatalysts, including the carrier-bound and carrier-free enzymes. These nanobiocatalysts provide enzymes with broad properties to serve in the fields of biocatalysis, biomedicine and biosensors.

Wang M., Si T., Zhao H. Biocatalyst development by directed evolution // Bioresour. Technol. 2012. Vol. 115. P. 117–125.

Biocatalysis has emerged as a great addition to traditional chemical processes for production of bulk chemicals and pharmaceuticals. To overcome the limitations of naturally occurring enzymes, directed evolution has become the most important tool for improving critical traits of biocatalysts such as thermostability, activity, selectivity, and tolerance towards organic solvents for industrial applications. Recent advances in mutant library creation and high-throughput screening have greatly facilitated the engineering of novel and improved biocatalysts. This review provides an update of the recent developments in the use of directed evolution to engineer biocatalysts for practical applications.

Wu B. et al. Aminomutases: mechanistic diversity, biotechnological applications and future perspectives // Trends in Biotechnology. 2011. Vol. 29, № 7. P. 352–362.

Aminomutases carry out the chemically challenging exchange of a hydrogen atom and an amine substituent present on neighboring carbon atoms. In recent years, aminomutases have been intensively investigated for their biophysical, structural and mechanistic characteristics. The reactions catalyzed by these enzymes have considerable potential for biotechnological applications. Here, we present an overview of this diverse group of enzymes, with a focus on enzymatic mechanisms and recent developments in their use in applied biocatalysis.

Yadav V.G. et al. The future of metabolic engineering and synthetic biology: Towards a systematic practice // Metab. Eng. 2012. Vol. 14, № 3. P. 233–241.

Industrial biotechnology promises to revolutionize conventional chemical manufacturing in the years ahead, largely owing to the excellent progress in our ability to re-engineer cellular metabolism. However, most successes of metabolic engineering have been confined to over-producing natively synthesized metabolites in E. coli. and S. cerevisiae. A major reason for this development has been the descent of metabolic engineering, particularly secondary metabolic engineering, to a collection of demonstrations rather than a systematic practice with generalizable tools. Synthetic biology, a more recent development, faces similar criticisms. Herein, we attempt to lay down a framework around which bioreaction engineering can systematize itself just like chemical reaction engineering. Central to this undertaking is a new approach to engineering secondary metabolism known as 'multivariate modular metabolic engineering' (MMME), whose novelty lies in its assessment and elimination of regulatory and pathway bottlenecks by re-defining the metabolic network as a collection of distinct modules. After introducing the core principles of MMME, we shall then present a number of recent developments in secondary metabolic engineering that could potentially serve as its facilitators. It is hoped that the ever-declining costs of de novo gene synthesis; the improved use of bioinformatic tools to mine, sort and analyze biological data; and the increasing sensitivity and sophistication of investigational tools will make the maturation of microbial metabolic engineering an autocatalytic process. Encouraged by these advances, research groups across the world would take up the challenge of secondary metabolite production in simple hosts with renewed vigor, thereby adding to the range of products synthesized using metabolic engineering.

Yang G., Ding Y. Recent advances in biocatalyst discovery, development and applications // Bioorg. Med. Chem. 2014. Vol. 22, № 20. P. 5604–5612.

Enzymes catalyze a wide range of biotransformations and have a great potential as environmentally friendly alternatives to classical chemical catalysts in various industrial applications. Recently, advanced techniques and strategies in enzyme discovery and engineering have led to the significant expansion of the quantity and functional diversity of biocatalysts, which has further allowed broader uses of biocatalysts in new processes, especially those traditionally enabled only by chemical catalysts. Here we highlight some of these recent advances with the focus on new approaches in biocatalyst discovery and development, and discuss new applications of selected biocatalysts including transaminases, cytochrome P450s, and Baeyer-Villiger monooxygenases.

Zhang F. et al. Structural DNA Nanotechnology: State of the Art and Future Perspective // Journal of the American Chemical Society. 2014. Vol. 136, № 32. P. 11198–11211.

A review. Over the past three decades DNA has emerged as an exceptional mol. building block for nanoconstruction due to its predictable conformation and programmable intra- and intermol. Watson-?Crick base-?pairing interactions. A variety of convenient design rules and reliable assembly methods have been developed to engineer DNA nanostructures of increasing complexity. The ability to create designer DNA architectures with accurate spatial control has allowed researchers to explore novel applications in many directions, such as directed material assembly, structural biol., biocatalysis, DNA computing, nanorobotics, disease diagnosis, and drug delivery. This Perspective discusses the state of the art in the field of structural DNA nanotechnol. and presents some of the challenges and opportunities that exist in DNA-?based mol. design and programming.

Zheng H., Reetz M.T. Manipulating the Stereoselectivity of Limonene Epoxide Hydrolase by Directed Evolution Based on Iterative Saturation Mutagenesis // J. Am. Chem. Soc. 2010. Vol. 132, № 44. P. 15744–15751.

Limonene epoxide hydrolase from Rhodococcus erythropolis DCL 14 (LEH) is known to be an exceptional epoxide hydrolase (EH) because it has an unusual secondary structure and catalyzes the hydrolysis of epoxides by a rare one-step mechanism in contrast to the usual two-step sequence. From a synthetic organic viewpoint it is unfortunate that LEH shows acceptable stereoselectivity essentially only in the hydrolysis of the natural substrate limonene epoxide, which means that this EH cannot be exploited as a catalyst in asymmetric transformations of other substrates. In the present study, directed evolution using iterative saturation mutagenesis (ISM) has been tested as a means to engineer LEH mutants showing broad substrate scope with high stereoselectivity. By grouping individual residues aligning the binding pocket correctly into randomization sites and performing saturation mutagenesis iteratively using a reduced amino acid alphabet, mutants were obtained which catalyze the desymmetrization of cyclopentene-oxide with stereoselective formation of either the (R,R)- or the (S,S)-diol on an optional basis. The mutants prove to be excellent catalysts for the desymmetrization of other meso-epoxides and for the hydrolytic kinetic resolution of racemic substrates, without performing new mutagenesis experiments. Since less than 5000 tranformants had to be screened for achieving these results, this study contributes to the generalization of ISM as a fast and reliable method for protein engineering. In order to explain some of the stereoselective consequences of the observed mutations, a simple model based on molecular dynamics simulations has been proposed.

АЛЕЕВА С.В., КОКШАРОВ С.А. Химия и технология биокатализируемого наноконструирования льняных текстильных материалов // РОССИЙСКИЙ ХИМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2011. 55. № 3. P. 46-58.

Получены уникальные потребительские свойства льняных тканей по новой технологии их заключительной отделки, что позволяет расширить возможности художественно-декоративного оформления льняных полотен.

БАЛАБАН Н.П., РУДАКОВА Н.Л., ШАРИПОВА М.Р. Структурные особенности и функциональная значимость метцинкиновых металлоэндопептидаз // БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. 2013. 39. № 5. P. 552-556.

В работе обсуждаются сведения о метцинкиновых металлоэндопептидазах, особенностях их структуры, физиологической роли этих ферментов в клетке и об их потенциале для использования в медицине. Рассматриваются собственные результаты исследования новой внеклеточной металлоэндопептидазы Bacillius pumilus, которая обладает уникальным сочетанием признаков астацинов и адамализинов двух семейств клана метцинкинов.

БАЧЕВА А.В. et al. Функциональная деградация основного белка миелина. протеомный подход // БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. 2011. 37. № 1. P. 45-54

Предметом настоящей работы является сравнительное исследование особенностей деградации одного из главных нейроантигенов, основного белка миелина, протеиназами, активируемыми при развитии патологического демиелинизирующего процесса, и протеасомой, выделенной из различных источников. Проведенное сравнение специфичности перечисленных биокатализаторов дает в ряде случаев основание судить о резком изменении набора пептидных фрагментов основного белка миелина, способных презентироваться на главном комплексе гистосовместимости первого класса при нейродегенерации, что, по всей видимости, способствует развитию аутоиммунной патологии.

БЕЗБОРОДОВ А.М., ЗАГУСТИНА Н.А. Липазы в реакциях катализа в органическом синтезе (обзор) // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2014. 50. № 4. P. 347-73.

В обзоре рассмотрены проблемы ферментативного катализа в реакциях органического синтеза, в которых катализатором является липаза. Кратко изложены данные о современных методах белковой инженерии и модификации ферментов, позволяющие расширить круг используемых субстратов. Показано участие липазы в получении лекарственных и агрохимических препаратов, лишенных неактивных энантиомеров, а так же в синтезе энантиомеров вторичных спиртов и оптически активных амидов. Обсуждается вопрос об участии липазы в формировании С--С связи в реакции Михаэля. Представлены данные о ферментативном синтезе конструкционных материалов - полиэфиров, силоксанов и др. Приведены примеры реализации процесса ферментативного катализа в промышленности с участием липазы.

БЕЛОВА Н.В., ШАМОЛИНА И.И. Некоторые перспективные направления биотехнологии базидиомицетов // МИКОЛОГИЯ И ФИТОПАТОЛОГИЯ. 2013. 47. № 2. P. 73-82.

Представлен обзор исследований, посвященных некоторым перспективным направлениям применения базидиомицетов. Отмечено, что различные виды грибов, а также метаболиты используются для создания пищевых, лекарственных и косметических средств. Базидиомицеты и ферменты (лакказы) находят применение в биоремедиации, утилизации различных промышленных, в том числе текстильных отходов, а также в биокатализе. Протеазы базидиомицетов востребованы в пищевом и кормовом производстве. Активные неферментные белки представляют большой интерес для медицины и промышленности.

БОРЗЕНКОВА Н.В. et al. Применение гемсодержащих биокатализаторов для окисления и определения сераорганических соединений // ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 2: ХИМИЯ. 2013. 54. № 2. P. 92-101.

Оптимизированы условия окисления дибензотиофена и алифатических фенотиазинов (промазина и хлорпромазина) в присутствии гемсодержащих биокатализаторов (таких, как пероксидаза хрена и гемоглобин). Показано, что гемоглобин является эффективным катализатором для быстрой и селективной конверсии дибензотиофена до соответствующего сульфоксида (выход 91±2% за 5 мин); пероксидаза хрена является более перспективным катализатором при окислении фенотиазинов. Изучено влияние полярного органического растворителя (диметилсульфоксида) на кинетические параметры реакции окисления промазина в присутствии гемсодержащих биокатализаторов. Разработаны методики определения фенотиазинов, основанные на спектрофотометрическом контроле за скоростью их окисления. Диапазоны определяемых концентраций для определения промазина и хлорпромазина с использованием пероксидазы хрена в водной среде составили 10-100 и 10-200 мкМ соответственно и 25-500 мкМ при определении промазина в присутствии 10 об.% диметилсульфоксида.

БОРОВКОВА И.С., ВОЛЬХИН В.В., КАЗАКОВ Д.А. Интенсификация биокаталитического окисления фенола активаторами межфазного переноса кислорода // КАТАЛИЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ. 2011. № 2. P. 66–72.

Транспорт кислорода из газовой фазы в водную определяет скорость биокаталитического окисления фенола. Для интенсификации процесса применены активаторы межфазного переноса О2, позволившие значительно повысить скорость поступления газа в реакционное пространство без дополнительного потребления энергии в отличие от широко применяемых методов перемешивания и барботажа. Исследовано влияние ряда веществ на KLa при варьировании скорости перемешивания от 100 до 1200 об/мин. Впервые со поставляются по эффективности твердо и жидкофазные активаторы. Максимальный рост KLa при разных гидродинамических условиях достигнут для активированного угля (в 3,7 раза), аэросила (в 1,5 раза), н-додекана (в 3,1 раза). Результаты объяснены «челночным» механизмом межфазного переноса О2. Показано, что при увеличении KLa с 2,8 до 18,5 ч-1 биокаталитическое окисление фенола ускоряется в 2,4 раза. Использование активированного угля как активатора межфазного переноса О2 позволяет повысить скорость биокаталитического окисления фенола примерно на 20 %.

ВЕСЕЛОВСКИЙ А.В., ИВАНОВ А.С., МЕДВЕДЕВ А.Е. Компьютерное моделирование моноаминоксидаз // БИОМЕДИЦИНСКАЯ ХИМИЯ. 2015. 61. № 2. P. 265-271.

Обобщены результаты многолетней работы по исследованию структуры активных центров моноаминоксидаз (МАО) методами компьютерного моделирования, выполненных в Институте биомедицинской химии (ИБМХ). МАО присутствует в организме млекопитающих в виде двух высокогомологичных белков (МАО А и МАО Б), отличающихся по субстратной специфичности, ингибиторной селективности и другим свойствам. Показано развитие подходов по моделированию структуры активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой на основе селективных ингибиторов. Отправной точкой исследований послужила обнаруженная зависимость между геометрическими размерами конформационно жёстких молекул ингибиторов и величиной их ингибиторной активности. Последующие работы привели к созданию модели слепка активного центра, который отражал геометрические размеры и форму активного центра. Показана возможность его использования для поиска новых ингибиторов в молекулярных базах данных. Приведены результаты работы по поиску селективных и неселективных ингибиторов МАО. Проведено сравнение полученных моделей со структурой активных центров кристаллических структур МАО, полученных позднее.

ВЛАХ Е.Г. et al. Деструкция полирибонуклеотидов: сочетание биокатализа и мониторинга продуктов // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2014. 50. № 6. P. 561-569.

На основе макропористых монолитных материалов, содержащих ковалентно связанную рибонуклеазу А созданы высокоэффективные проточные гетерогенные биокатализаторы (биореакторы). Определены кинетические параметры деструкции полицитидиловой кислоты и проведено сравнение свойств полученных систем. Разработан метод ВЭЖХ-мониторинга продуктов биокаталитической деструкции РНК, а также показана возможность использования биокаталитической и ВЭЖХ колонок в процессах деструкции РНК в многокомпонентной смеси биологических молекул.

ВЛАХ Е.Г., ПОНОМАРЁВА Е.А., ТЕННИКОВА Т.Б. Мультиферментный биореактор на основе комплекса хитиназ // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2014. 50. № 5. P. 475-480.

Получен гетерогенный биокатализатор, содержащий на поверхности макропористого монолитного минидиска комплекс хитинолитических ферментов, выделенных из культуральной среды бактерий Clostridium paraputrificum. Комплекс хитинолитических ферментов был совместно иммобилизован на полимерной матрице многоступенчатым методом, включающим введение промежуточного макромолекулярного спейсера. Проведено изучение эндохитиназной и N-ацетилглюкозаминидазной активности гетерогенного биокатализатора.

ГЛАДЧЕНКО М.А. et al. Оптимизация конверсии отходов аграрно-промышленного комплекса в летучие жирные кислоты в анаэробных условиях // ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 2: ХИМИЯ. 2014. 55. № 4. P. 241-248

Проведена селекция биокатализатора и впервые получена оптимальная микробная ассоциация, способная проводить конверсию продуктов деполимеризации опилок, лигнина и соломы в жирные кислоты с кислотогенной активностью, в 1,3 раза превышающей исходный метаногенный биокатализатор. Наибольший выход масляной кислоты (40%) и этанола (14%) был получен на гидролизованной биомассе из соломы при концентрации растворимых органических веществ от 2,5 до 6,3 г ХПК/л. На деполимеризованной биомассе из опилок и лигнина при концентрации органических веществ от 4,0 до 8,0 г ХПК/л и длительности процесса конверсии до 18 сут получен выход масляной кислоты в два раза меньший, чем на биомассе из соломы.

76. 035387
ГНЕДЕНКО О.В. et al. Белок-белковые взаимодействия в цитохром р450 3а4 и 3а5 системах // БИОМЕДИЦИНСКАЯ ХИМИЯ. 2014. 60. № 1. P. 17-27

Исследованы межмолекулярные взаимодействия между белками-партнерами монооксигеназной системы биотрансформации лекарственных препаратов: цитохромами Р450 3А4 и Р450 3А5 и цитохромом b 5. Цитохромы Р450 3А4 и Р450 3А5 образуют комплексы с каждой из форм цитохрома b 5 (микросомальная и митохондриальная формы – b 5mc и b 5om и две “химерные” конструкции b 5(om-mc), b 5(mc-om) ), причем существенное различие наблюдалось только во взаимодействии с b 5om. Определены электроаналитические характеристики электродов с иммобилизованными гемопротеинами: цитохромом Р450 3А4, Р450 3А5, b 5mc, b 5om, b 5(om-mc) и b 5(mc-om). Электрохимический анализ показал, что все эти белки обладают очень близкими редокс-потенциалами -0,435 - -0,350 (отн. Ag/AgCl). В то же время, наблюдалось стимулирующее влияние цитохрома b 5mc на электрокаталитические свойства цитохрома Р450 3А4


В результате расшифровки нуклеотидной последовательности генома термоалкалофильной липолитической бактерии Thermosyntropha lipolytica идентифицирован ген, кодирующий липазу, секретируемую в среду. Рекомбинантный фермент экспрессирован в Escherichia coli, проведены его выделение и предварительная функциональная характеристика. Липаза проявляла гидролитическую активность в отношении пара-нитрофениловых эфиров с различной длиной цепи, а также триглицеридов, в том числе растительных масел. Оптимальные условия реакции достигались при 70-80°С и рН 8.0. Фермент сохранял более 80% активности в присутствии 10% метанола. Выделенная новая термостабильная липаза может быть перспективным биокатализатором для органического синтеза, применения в пищевой промышленности, производстве моющих средств и получении биодизеля.

ЕФРЕМЕНКО Е.Н. et al. Иммобилизованные грибные биокатализаторы для получения комплекса целлюлаз, гидролизующего возобновляемое растительное сырье // КАТАЛИЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ. 2013. № 1. P. 68–77.

В статье обсуждаются характеристики процессов направленного формирования образцов гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных микроскопических грибов, характеризующихся высокой продуктивностью по целлюлазам, имеющим различную субстратную специфичность (эндоглюканазы, экзоглюканазы и бета-глюкозидазы). На основе исследования каталитических и операционных характеристик разработанных биокатализаторов отобраны образцы иммобилизованных клеток, характеризующиеся максимальной продуктивностью по ферментам целлюлазного комплекса. Установлено, что лучшим среди них является биокатализатор, разработанный на основе спор гриба Aspergillus terreus, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта. Впервые показано, что разработанный биокатализатор стабильно сохраняет высокий уровень продуктивности по полному комплексу целлюлаз при использовании различных субстратов–индукторов биосинтеза ферментов: березовых и дубовых опилок, рисовой и пшеничной соломы. Показана возможность эффективного использования целлюлазных комплексов, полученных как результат функционирования иммобилизованных клеток, в процессах осахаривания различных целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства и конверсии получаемых сахаров в органические растворители (этанол, бутанол), рассматриваемые как перспективные виды альтернативного топлива. Полученные при этом концентрации органических растворителей в средах с иммобилизованными клетками существенно выше тех, что установлены для свободных клеток тех же микроорганизмов.

ЗЕЙФМАН Ю.С. et al. Ферментативный синтез электропроводящих биокомпозитов на основе днк и оптически активного полианилина // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2012. 48. № 2. P. 169-174.

Методом окислительной полимеризации анилина с использованием двух различных биокатализаторов: пероксидазы из корней хрена и биомиметика микропероксидазы-11 синтезированы электропроводящие интерполимерные комплексы полианилина на матрице ДНК. Исследованы спектральные характеристики и морфология полученных биокомпозитов. Показано различие стереоспецифичности получаемых образцов интерполимерных комплексов в зависимости от используемого биокатализатора. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли биокатализатора в формировании направления закручивания спирали электропроводящего полимера на матрице ДНК, т.е. оптическая активность получаемых образцов полимеров, по-видимому, связана со свойствами биокатализатора.


С помощью культуры Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740 из 11 стероидов ряда андростана и прегнана при содержании субстрата в реакционной среде 0.5-10 г/л получены соответствующие 9-гидроксипроизводные. 9-Моногидроксилирование протекало независимо от строения заместителя при С17. Однако структура стероидной молекулы влияла на время полной конверсии субстрата и выход продукта трансформации. При максимальном количестве андростендиона (АД) 10 г/л 9 -гидрокси-АД образовывался через 35 ч с выходом 85%. 9-гидрокси-АД получали также с помощью клеток актинобактерии, включенных в криогель поливинилового спирта. При содержании в среде АД 4.0 г/л проведено 9 последовательных циклов трансформации с помощью иммобилизованных клеток. Содержание 9-гидрокси-АД, образуемого в 6 циклах продолжительностью 22 - 24 ч каждый, составляло 98%.

КОВАЛЕНКО Г.А. et al. Биокаталитические гетерогенные процессы переэтерификации растительных масел в биодизель // КАТАЛИЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ. 2014. № 6. P. 71–79.

Проведены исследования гетерогенного биокаталитического процесса переэтерификации растительных масел в этиловые эфиры жирных кислот с участием этанола или этилацетата и биокатализаторов, приготовленных путем включения в ксерогель диоксида кремния клеточных лизатов рекомбинантного штамма r E.сoli /lip, продуцирующего термостабильную липазу из Thermomyces lanuginosus. Процесс переэтерификации растительного масла проводили как в периодическом режиме в реакторе смешения, так и в непрерывном режиме в реакторе с неподвижным слоем приготовленного биокатализатора. Показано, что этилацетат является оптимальным ацилирующим реагентом в реакции переэтeрификации триглицеридов растительного масла в этиловые эфиры жирных кислот. В отличие от этанола этот реагент не инактивирует биокатализатор необратимо. Время полуинактивации биокатализаторов в изученных условиях составило 720 ч при 40°С.


Исследованы многокомпонентные композитные биокатализаторы с липолитической активностью, приготовленные путем включения клеток рекомбинантного штамма-продуцента термостабильной липазы из Thermomyces lanuginosus в SiO2-ксерогеле, содержащем наноуглеродный компонент - многослойные углеродные нанотрубки разного диаметра, а также углеродные наносферы луковичной структуры. Изучены свойства липазы как в клеточных суспензиях рекомбинантного штамма-продуцента, сконструированного на основе E. сoli BL21 (DE3), так и в иммобилизованном состоянии в зависимости от структуры и дисперсности наноуглеродного компонента, вводимого в состав биокатализаторов. Показано, что рекомбинантная внутриклеточная липаза проявляла активность в реакции гидролиза трибутирина, равную в среднем 50 Е/мг сухих клеток, и обладала высокой термостабильностью. При прогревании в оливковом масле при 100°С константа инактивации и время полуинактивации составили, соответственно, 6x10-3 /мин и 2 ч, что на порядок превышает термостабильность липазы в буфере. Биокатализаторы с введенными в их состав агрегированными “толстыми” нанотрубками диаметром 20-22 нм проявляли максимальную начальную активность 250 Е/г.

КОВАЛЕНКО Г.А. et al. Иммобилизация рекомбинантного штамма-продуцента глюкозоизомеразы в ксерогеле диоксида кремния и свойства приготовленных биокатализаторов // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2011. 47. № 2. P. 168-175.

Разработан оригинальный способ иммобилизации нерастущих клеток микроорганизмов в ксерогеле диоксида кремния, содержащем нерастворимые гидроксосоединения кобальта(II). На основе Escherichia coli с использованием гена Arthrobacter nicotianae сконструирован рекомбинантный штамм-продуцент глюкозоизомеразы. Обнаружено, что активность глюкозоизомеразы и стабильность биокатализаторов, приготовленных на основе рекомбинантного штамма E. coli, в 3-5 раз выше по сравнению с биокатализаторами, приготовленными с использованием штамма-донора A. nicotianae. В условиях непрерывного гидролиза 3 М фруктозы при 62-65°С в реакторе с неподвижным слоем время полуинактивации биокатализаторов, приготовленных на основе рекомбинантного штамма и A. nicotianae, было 60 и 25 сут соответственно.

КОВАЛЕНКО Г.А. et al. Исследование физико-химических свойств биокатализаторов с активностью термостабильной липазы и конечных продуктов переэтерификации триглицеридов // БИОТЕХНОЛОГИЯ. 2013. № 6. P. 35–50.

Исследованы физико-химические свойства многокомпонентных биокатализаторов переэтерификации триглицеридов, приготовленных путем включения в ксерогель диоксида кремния частично или полностью разрушенных клеток рекомбинантного штамма rExoliHip, продуцирующего термостабильную липазу из Thermomyces lanuginosus. Изучена функциональная роль и оптимальное содержание вводимых в состав биокатализаторов компонентов — целых клеток или клеточных лизатов, воды, влагоудерживающих агентов и наностуктурированных форм углерода (углеродные нанотрубки, наносферы). Подобран оптимальный состав биокатализаторов, приготовленных на основе клеточных лизатов rE.coli/lip, обладающих ферментативной активностью в безводных средах. При переэтерификации масложировых смесей в проточном реакторе с неподвижным слоем время полуинактивации приготовленных биокатализаторов составляет ~70 ч при 70—75°.

КУРОЧКИНА В.Б. et al. Гидролазы эфиров альфа-аминокислот: свойства и применение // БИОТЕХНОЛОГИЯ. 2012. № 5. P. 8–37.

В обзоре описаны две основные группы гидролаз эфиров альфа-аминокислот (aльфа-amino acid ester hydrolase, АЕН), которые имеют общие особенности строения активного центра ферментов, определяющие их уникальную специфичность к эфирам, содержащим аминогруппу в aльфа-положении по отношению к карбонильной. Первая группа включает микробные АЕН, относящиеся к ацилазам ?-лактамов. Технологические биокатализаторы, созданные на основе этой группы ферментов, применяют для получения полусинтетических амино-?-лактамных антибиотиков. Вторая группа АЕН представлена эукариотическими ферментами валацикловиразами, активирующими in vivo ряд предшественников лекарственных препаратов широкого спектра антивирусного и противоракового действия. Направленное действие ферментов этой группы используют при создании целевых (таргетных) фармацевтических препаратов, применяемых в терапии вирусных и онкологических заболеваний. Обобщены и сопоставлены имеющиеся в литературе сведения о структуре и свойствах ферментов обеих групп АЕН, их субстратной специфичности и кинетических параметрах; обсуждаются результаты исследований по идентификации активного центра АЕН обеих групп, подтверждающие на молекулярном уровне их уникальную специфичность. Для АЕН, относящихся к ацилазам ?-лактамов, собраны и систематизированы имеющиеся в научной и патентной литературе данные по синтезу аминопенициллинов и аминоцефалоспоринов, катализируемому этими ферментами.

ЛАВРОВ К.В., ЛАРИКОВА Г.А., ЯНЕНКО А.С. Новый биокаталитический процесс — синтез N-замещенных акриламидов // БИОТЕХНОЛОГИЯ. 2012. № 4. P. 26–30.

Впервые продемонстрирован ферментативный синтез N-замещенных акриламидов (N-изопропилакриламида и ?,?-диметиламинопропилакриламида) с помощью клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37, обладающих ациламидазной активностью. Субстратами синтеза являются акриламид и изопропиламин/диметиламинопропиламин, растворенные в воде. Оптимальные условия синтеза N-замещенных акриламидов определены на примере N-изопропилакриламида. Максимальный выход достигается при рН 9,5—10,5, соотношении субстратов акриламид:изопропиламин в диапазоне 1,3:1—2:1 и абсолютной концентрации субстратов 8,0% акриламида и 4,0% изопропиламина. При оптимальных условиях синтезируется до 22 г/л N-изопропилакриламида.

ЛАКИНА Н.В. et al. Биокаталитический способ получения триметилгидрохинона // ИЗВЕСТИЯ ВЫСШИХ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ. СЕРИЯ: ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ. 2011. 54. № 3. P. 78-81.

Предложен новый подход к синтезу полупродукта витамина Е - триметилгидрохинона с использованием иммобилизованной пероксидазы (КФ 1.11.07.) Рассмотрены основные методы получения триметилгидрохинона, представлен обзор новых каталитических способов его получения. Приведены результаты исследований, показывающие высокую эффективность биокаталитического способа синтеза триметилгидрохинона с применением нативного и иммобилизованного фермента.

МАКСИМОВА Ю.Г. et al. Каталитические свойства нитрилгидратазы, иммобилизованной на активированном хитозане // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2012. 48. № 5. P. 484-489.

Исследованы каталитические свойства нитрилгидратазы, изолированной из штамма Rhodococcus ruber gtl и иммобилизованной методом ковалентнои сшивки с хитозаном, активированным 0.1%-ным раствором бензохинона. Определены кинетические параметры реакции гидратации акрилонитрила, катализируемой иммобилизованной нитрилгидратазой и ферментом в растворе. Установлено, что иммобилизация не приводит к снижению максимальной скорости реакции (Vмакс), тогда как константа Михаэлиса (КM) уменьшается в 2.4 раза. Показана возможность многократного использования иммобилизованного фермента на протяжении 50 последовательных циклов трансформации акрилонитрила, причем активность нитрилгидратазы в 50 цикле превышала таковую в первом цикле в 3.5 раза. Показано, что влияние температуры на активность зависело от концентрации фермента, что подтверждает диссоциативный характер инактивации нитрилгидратазы. Обнаружено, что иммобилизованная нитрилгидратаза сохраняет активность при рН 3.0-4.0, тогда как фермент в растворе в этих условиях инактивируется. Полученный биокатализатор может эффективно использоваться для получения акриламида из акрилонитрила.

МАКСИМОВА Ю.Г. et al. Каталитические свойства нитрилгидратазы, иммобилизованной на оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2010. 46. № 4. P. 416-421.

Нитрилгидратаза, выделенная из штамма Rhodococcus ruber gt1, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, иммобилизована на немодифицированных оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах, в том числе на углеродном носителе Сибуните. Изучена активность и операционная стабильность адсорбированной нитрилгидратазы в реакции трансформации акрилонитрила в акриламид. Показано, что повышение содержания углерода в составе носителя приводило к возрастанию количества адсорбированного фермента и, в то же время, к снижению его активности. Наибольшей операционной стабильностью в процессе гидратации акрилонитрила обладала нитрилгидратаза, иммобилизованная на Сибуните и углеродсодержащем оксиде алюминия, имеющем коровое строение. Обнаружено, что при адсорбции термостабильность нитрилгидратазы повышалась на порядок.

МАКСИМОВА Ю.Г. et al. Трансформация 2- и 4-цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилгидролизующих бактерий // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2013. 49. № 4. P. 358-363.

Изучена динамика трансформации 2- и 4-цианопиридина суспендированными и адсорбированными на неорганических носителях клетками штамма Rhodococcus ruber gt1, обладающего нитрилгидратазной активностью, и Pseudomonas fluorescens C2, содержащими нитрилазу. Определено, что и нитрилгидратазная, и нитрилазная активность по 2-цианопиридину у иммобилизованных клеток в 1.5-4 раза ниже, чем таковая по 4-цианопиридину, и в 1.6-2 раза ниже, чем активность свободных клеток по 2-цианопиридину. Показана возможность получения изоникотиновой кислоты при совместной конверсии 4-цианопиридина смешанной суспензией клеток штамма R. ruber gt1 с высокой нитрилгидратазной активностью и R. erythropolis 11-2 с выраженной амидазной активностью. Показано, что иммобилизация клеток родококков на угле-сырце и клеток псевдомонад на каолине позволяет получить гетерогенный биокатализатор для эффективной трансформации цианопиридинов в соответствующие амиды и карбоновые кислоты.

МАКСИМОВА Ю.Г. et al. Трансформация амидов адгезированными клетками родококков, обладающими амидазной активностью // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2015. 51. № 1. P. 53-58.

Адгезией амидазосодержащих клеток родококков на березовом активном угле (БАУ) и угле-сырце получен гетерогенный биокатализатор для гидролиза амидов. Изучены свойства полученного биокатализатора в реакции гидролиза акриламида до акриловой кислоты и никотинамида до никотиновой кислоты, а также в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида до D- и L-изомеров молочной кислоты. Показано, что при повышении концентрации адгезированных и суспендированных клеток в 6 и 3 раза соответственно амидазная активность снижалась в 3 и 30 раз соответственно. Адгезированные на БАУ клетки сохраняли более 50% активности на протяжении семи 24-часовых циклов гидролиза акриламида, тогда как суспендированные клетки теряли более 60% активности уже во втором цикле. Отмечено, что при адгезии клеток на БАУ снижалась стереоселективность реакции гидролиза рацемического лактамида.

МАКСИМОВА Ю.Г. Микробные биопленки в биотехнологических процессах // БИОТЕХНОЛОГИЯ. 2013. № 4. P. 9–23.

В обзоре обобщены сведения, касающиеся следующих биотехнологических аспектов применения биопленок микроорганизмов: для биодеградации органических веществ и других контаминантов при очистке сточных вод, в процессах биосинтеза и биокатализа. Рассмотрены основные типы реакторов, в которых реализуются биотехнологические процессы, основанные на жизнедеятельности биопленок микроорганизмов. Отмечены преимущества и недостатки использования биокатализаторов в виде биопленок микроорганизмов для биотрансформации органических веществ.

МАТВЕЕВА О.В. et al. Влияние способа иммобилизации пероксидазы на активность биокатализатора в процессе окисления триметилфенола // КАТАЛИЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ. 2015. № 1. P. 70–78.

В работе исследована активность биокатализаторов на основе фермента пероксидазы, иммобилизованной на Al2O3, SiO2 и на магнитных наночастицах Fe3O4, использование которых является перспективным направлением в биотехнологии. Активность полученных биокатализаторов изучалась в каталитическом процессе окисления 2,3,6-триметилфенола до 2,3,5-триметилгидрохинона, который является полупродуктом синтеза витамина Е. В работе показаны преимущества использования магнитных наночастиц Fe3O4 для иммобилизации пероксидазы в каталитическом синтезе 2,3,5-триметилгидрохинона. Подобраны оптимальные условия проведения процесса окисления 2,3,6-триметилфенола: рН 7,2, температура 50°С. Методика синтеза магнитных наночастиц Fe3O4 с использованием недорогих исходных материалов и исследованный в работе способ каталитического окисления ТМФ до ТМГХ (полупродукта синтеза витамина Е) могут быть рекомендованы как альтернатива классическому промышленному способу получения ТМГХ.

МАТВЕЕВА О.В. et al. Преимущества использования магнитных наночастиц для иммобилизации пероксидазы в синтезе полупродукта витамина Е // ИЗВЕСТИЯ ВЫСШИХ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ. СЕРИЯ: ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ. 2014. 57. № 6. P. 15-18.

Одним из перспективных направлений в изучении процессов тонкого органического синтеза является применение в качестве каталитических систем иммобилизованных ферментов. Работа посвящена синтезу новых биокаталитических систем на основе пероксидазы (КФ 1.11.07), иммобилизованной на неорганические носители SiO2, Al2O3 и магнитные наночастицы ?-Fe3O4. Проведена сравнительная характеристика активностей и стабильности полученных биокаталитических систем в процессе окисления триметилфенола до триметилгидрохинона - полупродукта витамина Е. В работе показано, что наибольшей активностью и стабильностью обладает биокатализатор на основе пероксидазы, иммобилизованной на стабилизированные цитратом натрия магнитные наночастицы ?-Fe3O4.

МАТВЕЕВА О.В. et al. Современные тенденции применения оксидоредуктаз в промышленности // ИЗВЕСТИЯ ВЫСШИХ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ. СЕРИЯ: ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ. 2013. 56. № 11. P. 13-17.

Оксидоредуктазы – класс ферментов, широко используемый в фармацевтической, пищевой, биотехнологической промышленности, медицине и аналитической химии, как эффективные и экологически чистые биокатализаторы для проведения окислительно-восстановительных реакций. В представленном обзоре отражены современные тенденции применения лакказ, пероксидаз и глюкооксидаз.

НАЗАРОВ Н.М., СИНЯК Ю.Е. Основные итоги исследований по разработке гетерогенных биокатализаторов для очистки регенерированной воды от вредных примесей // АВИАКОСМИЧЕСКАЯ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА. 2012. Vol. 46. № 4. P. 17-21.

Биологический метод очистки воды конденсата атмосферной влаги обитаемых гермообъектов основан на применении биофильтра с гетерогенным биокатализатором, полученным путем иммобилизации безвредных для человека, животных и растений микроорганизмов на нерастворимом в воде твердом носителе – пенополивинилформале, а также биофильтра для очистки воды от перекиси водорода иммобилизованным на триацетатцеллюлозе ферментом – каталазой. Особое значение имеют результаты исследования по формированию иммобилизованной бактериальной ассоциации как модели полиферментной системы, открывающей широкие перспективы в области биотехнологии. Показана возможность получения биокатализатора с расширенным спектром действия путем иммобилизации на пенополивинилформале ассоциативной бактериальной культуры, включающей Paracoccus denitrificans, Pseudomonas esterophilus, Methilopila capsulat а. Гетерогенный биокатализатор в аэробных условиях при комнатной температуре способен трансформировать вредные органические примеси конденсата атмосферной влаги – метиламина, этилацетата, уксусной кислоты, этилового спирта, ацетона - до конечных продуктов – диоксида углерода, воды. Аммиак используется 3 культурами в качестве источника азотного питания.

НОВОЖИЛОВ Е.В. et al. Применение комплексных биокатализаторов на основе рекомбинантных ферментных препаратов Penicillium verruculosum для гидролиза полуцеллюлозы из лиственной древесины // КАТАЛИЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ. 2014. № 4. P. 74–80.

Проведено сравнительное исследование эффективности применения биокатализаторов на основе рекомбинантных ферментных препаратов, полученных с использованием гриба Penicillium verruculosum, для гидролиза полуцеллюлозы из лиственной древесины. Определена активность биокатализаторов по отношению к различным видам полуцеллюлозы и зависимость глубины исчерпывающего гидролиза от ее размола и высушивания. Показано, что полуцеллюлоза после варки с зеленым щелоком обладает высокой реакционной способностью по отношению к ферментативному гидролизу целлюлазным комплексом и представляет несомненный интерес в качестве субстрата при масштабировании биотехнологических процессов биоконверсии возобновляемого растительного сырья.

НОГОВИЦИНА Е.М., ГРИШКО В.В., ИВШИНА И.Б. Биокаталитическое получение фармакологически перспективного стигмаст-4-ен-3-она с использованием клеток родококков // БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. 2011. 37. № 5. P. 697-704.

Подобраны условия направленного биокаталитического окисления бета-ситостерина в фармакологически перспективный стигмаст-4-ен-3-он с использованием актинобактерий рода Rhodococcus. Показано, что применение пальмитиновой кислоты в качестве индуктора холестериноксидазной реакции ускоряет процесс биоконверсии бета-ситостерина в стигмаст-4-ен-3-он с 7 до 5 сут. Максимальная степень образования стигмаст-4-ен-3-она достигается при использовании н-гексадекана в качестве дополнительного ростового субстрата. При повышенном (до 2 г/л) содержании бета-ситостерина эффективное (80%) образование целевого продукта достигается в присутствии Твина-80 и бета-циклодекстрина. У штаммов R. erythropolis найдена наибольшая стеринтрансформирующая активность, в 1.5-2 раза превышающая таковую представителей R. ruber.

ПАВЛОВ И.Н. Установка для исследования биокаталитического превращения продуктов переработки недревесного сырья // КАТАЛИЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ. 2014. № 1. P. 68–74.

Разработана и изготовлена оригинальная установка (ферментер) для исследования биокаталитических превращений продуктов переработки возобновляемого целлюлозосодержащего сырья. Установка апробирована в процессе ферментативного гидролиза технической целлюлозы российского мискантуса. Полученные результаты (зависимость концентрации редуцирующих веществ в гидролизате от продолжительности ферментативного гидролиза) полностью воспроизвели результаты, полученные ранее на лабораторном оборудовании. Проведенное параллельно в лаборатории и в ферментере сбраживание полученного гидролизата также продемонстрировало идентичность результатов. Таким образом, доказана перспективность установки для приготовления ферментативных гидролизатов, пригодных для использования в качестве субстратов в технологии получения биоэтанола и бактериальной целлюлозы, и возможность масштабирования по объему процессов биокаталитической трансформации.


Рассчитаны Кm для L-фенилаланина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты и соответствующих кетокислот, а также Vmax для пар субстратов: L-фенилаланин-2-кетоглутарат, L-фенилаланин оксалоацетат, L-глутаминовая кислота фенилпируват и L-аспарагиновая кислота фенилпируват для аминотрансфераз PAT1, PAT2 и PAT3 Erwinia carotovora subsp. carotovora ИНМИА № 8724, катализирующих переаминированиe фенилпирувата. Аминотрансфераза PAT3 ингибировалась 2-кетоглутаратом (Ks 10.23 ± 3.20 мМ) и оксалоацетатом (Ks 3.73 ± 1.99 мМ). Конкурентным ингибитором РАТ1 являлся L- -(N-бензиламино)аланин при использовании в качестве субстрата L-фенилаланина (KI = 0.32 ± 0.07 мM, Km = 0.45 ± 0.1 мM, Vmax = 11.6 ± 0.4 ед./мг) при концентрации 2-кетоглутарата в реакционной среде 25 мМ. L- -(N-метиламино)аланин бесконкурентный ингибитор для PAT3 при той же паре субстратов (KI = 138.4 ± 95.4 мМ, Km = 13.7 ± 3.9 мМ, Vmax = 18.6 ± 4.1 ед./мг) и концентрации 2-кетоглутарата 2 мМ в реакционной среде. Исследованы L-стереоизомеры некоторых небелковых аналогов ароматических аминокислот в качестве субстратов для PAT1, PAT2 и PAT3.

ПРОСКУРИНА О.В. et al. Применение технологии «фъюжн» для создания высокоэффективных биокатализаторов на основе рекомбинантных штаммов гриба Penicillium verruculosum для конверсии целлюлозосодержащей биомассы // КАТАЛИЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ. 2013. № 5. P. 65–73.

Гидролиз целлюлозосодержащей биомассы под действием биокатализаторов (ферментных препаратов, ФП) – один из самых перспективных и экологически чистых методов получения ряда полезных продуктов. В данной работе использован принципиально новый подход к созданию рекомбинантных ФП с заданными свойствами, заключающийся в применении фъюжн-конструкции для клонирования генов целевых ферментов. На основе штамма гриба Penicillium verruculosum при использовании фъюжн-конструкции создан ряд ФП с различными свойствами, представляющими интерес, в первую очередь, как добавки для увеличения гидролитической способности базового целлюлолитического комплекса P.verruculosum. Совместное использование новых ФП и базового ФП P.verruculosum позволило увеличить его биокаталитическую (гидролитическую) эффективность по отношению к растительному целлюлозосодержащему сырью. При добавлении 20 % нового ФП к базовому без изменения суммарной дозировки ФП в реакционной смеси рост эффективности гидролиза целлюлозосодержащих субстратов (измельченной осиновой древесины и измельченной обессмоленной сосновой древесины) составляет до 70 %.

ПРОСКУРИНА О.В. et al. Эндоглюканаза IV Trichoderma reesei – новый компонент биокатализаторов на основе целлюлазного комплекса гриба Penicillium verruculosum для гидролиза целлюлозосодержащей биомассы // КАТАЛИЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ. 2013. № 6. P. 73–80.

Одной из актуальных технологических задач на сегодняшний день является повышение эффективности ферментных препаратов, осуществляющих конверсию целлюлозы. В данной работе рассмотрен новейший метод повышения гидролитической способности целлюлазных препаратов, заключающийся во введении ферментов негидролитического типа действия (полисахарид монооксигеназ) в целлюлолитический комплекс. На основе рекомбинантного штамма гриба Penicillium verruculosum, несущего ген эндоглюканазы IV Trichoderma reesei, был получен ферментный препарат с увеличенной гидролитической способностью. Использование данного метода позволило повысить эффективность целлюлазного комплекса на 20 %.

СИСТЕР В.Г. et al. Некоторые аспекты биокаталитического синтеза незаменимых аминокислот в процессе биоконверсии органических отходов // ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ. 2012. 13. № 8. P. 474-481.

В работе представлен обзор литературных источников, в котором подробно рассмотрены основы микробиологического синтеза аминокислот в процессе биоконверсии и влияние различных факторов на интенсивность процесса. Микробиологический синтез аминокислот сегодня является перспективным и экономически выгодным способом производства. В процессе ферментации непосредственно синтезируются незаменимые L-аминокислоты.

СКЛЯРЕНКО А.В. et al. Рекомбинантная гидролаза эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915 - высокоэффективный биокатализатор синтеза цефалексина // ВЕСТНИК МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ 2:B49 ХИМИЯ. 2014. 55. № 2. P. 86-92.

Исследована эффективность гидролазы эфиров альфа-аминокислот из бактерии Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915 (XrAEH, КФ в синтезе амино-бета-лактамного антибиотика цефалексина. Показано, что XrAEH, продуцируемая рекомбинантным штаммом Escherichia coli ВКПМ В-11246 (r-XrAEH), по эффективности синтеза цефалексина значительно превосходит нативный фермент wt-XrAEH, получаемый из мутантного штамма Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915. При использовании в качестве биокатализатора r-XrAEH добавление в реакционную среду этиленгликоля в концентрации 33 об.% позволяет повысить выход целевого продукта с 70 до 95%. При проведении синтеза цефалексина в оптимальных условиях в случае нативного фермента wt-XrAEH выход цефалексина составлял 85% по сравнению с 95% для r-XrAEH. Кроме того, в отличие от ферментных препаратов нативной wt-XrАЕН препараты рекомбинантной r-XrAEH не обладают побочной бета-лактамазной активностью.

СУЛЕЙМАНОВА А.Д. et al. Новая бактериальная внутриклеточная фитаза энтеробактерий: выделение и характеристика // БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. 2013. 39. № 4. P. 424-429

Впервые из клеточного лизата энтеробактерий Pantoea vagans 3.2 выделена и исследована фитаза(мио-инозитол-1,2,3,4,5,6-гексакисфосфат-фосфогидролаза), отнесенная к классу гистидиновых кислых фосфатаз (КФ Фермент очищен до гомогенного состояния, установлена его первичная структура. Молекулярная масса белка составила 46 кДа, Km - 0.28 мМ. Изучены некоторые физико-химические свойства фермента.


Термостабильная бета-глюкозидаза (TmBglA) из Thermotoga maritima перспективный биокатализатор для получения изофлавоновых агликонов. Для эффективного гидролиза соевых изофлавоновых конъюгатов необходим поиск ферментов с высокой специфичностью к природным субстратам. Изучено влияние аминокислот, расположенных в агликонсвязывающем кармане с неконсервативными остатками специфичных групп фермента, принадлежащего семейству 1 гликозидгидролаз (GH1), с использованием TmBglA (дикого типа) из T. maritima и трех мутантных, в которых были произведены замены аминокислот М1-TmBglA, М2-TmBglA и М1М2-TmBglA. Три мутантных белка были экспрессированы в Escherichia coli, выделены и охарактеризованы. Мутации привели к сдвигам в значениях оптимальной температуры, термостабильности, сужению кривой рН-зависимости в результате удаления ионизированной боковой цепи. Все мутации снижали эффективность катализа, по отношению к природным субстратам, таким как гликозид салицина, по сравнению с синетическим р-нитрофенил- -D-глюкопиранозидом. Это свидетельствует о том, что замененные аминокислоты являются ключевыми, определяющими специфичность к агликону. Меньшая степень гидролиза генистеина и даидзеина ферментом M2-TmBglA, по сравнению с M1-TmBglA, свидетельствовала в пользу того, что остатки L400, A407 и E408 в TmBglA в большей степени необходимы для проявления каталитической активности и связывания соевого изофлавонового гликозида, чем V170, A171, V173, G174, H180.

ЧЕКУШИНА А.В. et al. Ферментные препараты Penicillium verruculosum для биоконверсии растительного сырья — альтернатива коммерческим препаратам, полученным с помощью грибов рода Trichoderma // БИОТЕХНОЛОГИЯ. 2013. № 3. P. 69–80.

Проведено сравнительное исследование лабораторного ферментного препарата, полученного с помощью гриба Penicillium verruculosum, и коммерческого целлюлолитического препарата Cellic CTec-2, являющегося в настоящее время одним из наиболее эффективных для биоконверсии растительного целлюлозосодержащего сырья. Сопоставлены значения удельной активности этих ферментных препаратов по ряду специфических субстратов, рН- и температурного оптимума активности; изучены стабильность, качественный и количественный компонентный состав препаратов, а также предельная степень конверсии четырех видов растительного целлюлозосодержащего сырья (предобработанные паровым взрывом кукурузные стебли и багасса, измельченная древесина сосны и осины) в ходе их гидролиза этими ферментными препаратами. Установлено, что лабораторный препарат P. verruculosum и коммерческий препарат Cellic CTec-2 обладают примерно одинаковыми характеристиками, определяющими целесообразность применения биокатализаторов в промышленной биотехнологии, и следовательно, первый является конкурентоспособным при использовании для биоконверсии возобновляемого растительного сырья.

ЧЕКУШИНА А.В., ДОЦЕНКО Г.С., СИНИЦЫН А.П. Сравнение эффективности процессов биоконверсии растительного сырья с использованием биокатализаторов на основе ферментных препаратов Trichoderma и Penicillium Verruculosum // КАТАЛИЗ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ. 2012. № 6. P. 68–76.

Проведено сравнительное исследование эффективности применения шести коммерческих биокатализаторов на основе ферментных препаратов, полученных с использованием гриба рода Trichoderma в качестве продуцента (Cellic Ctec 1, Cellic Ctec 2, Accelerase 1000, Accelerase 1500, Accelerase XY, Accelerase DUET), и лабораторных биокатализаторов на основе ферментных препаратов, полученных с использованием гриба Penicillium verruculosum, для гидролиза четырех видов растительного целлюлозосодержащего сырья (предварительно обработанные паровым взрывом кукурузные стебли и багасса, измельченная древесина сосны и осины), а также микрокристаллической целлюлозы. Определены активности биокатализаторов по отношению к различным субстратам и зависимость глубины исчерпывающего гидролиза растительного сырья от дозировки этих биокатализаторов. Показано, что биокатализаторы, созданные на основе штаммов P. verruculosum, являются конкурентоспособными по отношению к широко используемым коммерческим биокатализаторам на основе штамма Trichoderma при масштабировании биотехнологических процессов биоконверсии возобновляемого растительного сырья.

ШАКИРОВ A.Н. et al. Поиск биокатализаторов для кинетического разделения рацемического 2 бром 1 (4 нитрофенил)этанола // БАШКИРСКИЙ ХИМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2011. 18. № 4. P. 114-117.

Изучено парциальное ацетилирование 2-бром-1- (4-нитрофенил)этанола винилацетатом при 30 оС в присутствии липазы Novozymе 435 и обезвоженных ацетоном клеток бактерий (9 культур) в различных органических растворителях (толуоле, тетрагидрофуране, изооктане), а также в бинарных смесях изооктана с тетрагидрофураном или ацетоном. Обнаружено, что при 30 оС наиболее эффективно трансформация протекает в системе изооктан-ацетон в присутствии липазы Novozymе 435 и клеток Bacillus sp. 77-34. Показано, что увеличение температуры до 45 оС приводит к существенному ускорению процесса в присутствии Novozymе 435 и позволяет дости чь 95% энантиомерного избытка превалирующего энантиомера 2-бром-1-(4-нитрофенил)этанола через 80 ч трансформации.

ШАРАЕВА А.А. et al. Парциальное ацетилирование рацемического 1-гептен-3-ола винилацетатом в присутствии клеток морфологических диссоциантов актинебактерий Rhodococcus sp. USPTU - 21 // БАШКИРСКИЙ ХИМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2013. 20. № 4. P. 49-53.

Исследован биокаталитический метод получения ( S )-1-гептенил-3-ацетата с помощью морфологических R и S -диссоциантов культуры Rhodococcus sp. USPTU-21. Показано, что парциальное ацилирование рацемического 1-гептен-3-ола винилацетатом в изооктане, содержащем 5% ацетона, в присутствии S -диссоцианта, образующего слизистые колонии при росте на агаризованной среде за счет образования внеклеточного полимера, протекает более быстро и с большим выходом продукта – ( S )-1-гептенил-3-ацетата, чем в присутствии клеток R -диссоцианта. В то же время в присутствии клеток R -диссоцианта, формирующего морщинистые колонии и неспособного синтезировать внеклеточный полимер, ацилирование протекает более селективно и позволяет получать более энантиомерно чистый ( S )-1-гептенил-3-ацетат.

На главную              К списку выставок